Cd248+cd8+t细胞亚群在人升主动脉瘤病变过程中的作用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新的细胞亚群在人升主动脉瘤病变过程中的作用。属于生物医 药，细胞生物学，心脏大血管外科领域。
【背景技术】
[0002] 胸主动脉瘤是指胸部主动脉部分异常扩张，变形，呈瘤样突出，可发生在主动脉根 部、升主动脉、主动脉弓或降主动脉等部位。本病早期多无症状和体征，后期瘤体增大后压 迫周围组织出现症状，瘤体一旦破裂，十分危重，死亡率高。胸主动脉瘤的发病机制非常复 杂，除染色体缺陷所致的马凡氏综合征之外，可能涉及血流动力学变化、透壁炎症反应等， 但具体发病机制尚无定论。目前研宄表明，升主动脉瘤（ATAA)的病理学特征主要有血管增 生、慢性炎症以及细胞外基质的退化几方面。
[0003] ⑶248又名内皮唾液酸蛋白，也被称为肿瘤内皮标志物-1 (tumor endothelial marker-1)，是一种跨膜糖蛋白，在周细胞、成纤维细胞表面广泛表达，在炎性区域以及肿瘤 新生血管中表达水平较高。已有文献指出，CD248在人类大部分肿瘤血管内皮表面都有所 表达，但在正常组织血管内皮不表达。升主动脉瘤的病理过程涉及血管的增生，但目前尚无 关于CD248在升主动脉瘤中作用的研宄。
[0004] 本发明首先阐明了⑶248在对照组和主动脉瘤组中外周血和组织局部的表达差 异，并将⑶248定位于⑶8+T细胞上，即发挥作用的主要是⑶248+⑶8+T细胞亚群。通过体 外实验证明，该亚群细胞可以通过降低炎性反应，抑制内皮细胞迀移减轻升主动脉瘤的病 变进程。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供⑶248作为主动脉瘤诊断标志物的作用。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种新的细胞亚群即⑶248+⑶8+T细胞亚群在人 主动脉瘤病变中的潜在保护作用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明提供了CD248在制备用于诊断主动脉瘤的制剂或试剂 盒中的应用。
[0008] 本发明还提供了一种用于诊断主动脉瘤的试剂盒，其特征在于，包括用于检测 CD248含量的试剂。所述的用于检测CD248含量的试剂为抗人CD248抗体以及抗人CD248 ELISA试剂盒中的至少一种。
[0009] 优选地，所述的用于检测⑶248含量为检测外周血或主动脉血管壁中⑶248含量。
[0010] 本发明还提供了一种⑶248+⑶8+T细胞亚群，其特征在于，其制备方法包括：收集 健康人的外周血，用ficoll分离液，采用密度梯度离心法分离得到单个核细胞，用PBS缓 冲液以及staining buffer洗涤，再用1% BSA溶液封闭，加入兔抗人CD248抗体，4°C孵育 30mins，洗涤后，加入抗兔647荧光二抗以及抗人⑶8-FITC流式抗体和抗人⑶3-PE流式抗 体，4°C避光孵育30mins后洗涤、重悬后上机，用流式分选仪分别收集⑶248+⑶8+T细胞亚 群以及⑶248-⑶8+T细胞亚群。
[0011] 本发明还提供了⑶248+⑶8+T细胞亚群在制备用于治疗主动脉瘤的制剂或试剂 盒中的应用。
[0012] 本发明还提供了一种用于治疗主动脉瘤的制剂或试剂盒，其特征在于，包含 CD248+CD8+T细胞亚群。
[0013] 本发明中所述的与对照组相比，⑶248在主动脉瘤患者外周血中表达降低，组织局 部表达升高，通过以下方法检测：（1)取对照组和主动脉瘤组患者外周血，分离出外周血单 个核细胞，用流式细胞仪检测CD248表达量差异。（2)取对照组主动脉壁和主动脉瘤病灶区 血管壁，提取RNA后PCR测定⑶248表达量差异。
[0014] 本发明所述的⑶248+⑶8+T细胞在人主动脉瘤病变中的潜在保护作用，通过下述 步骤证明：（1)用流式细胞分选法，从对照组外周血单个核细胞中分选出⑶248+⑶8+T细胞 与⑶248-⑶8+T细胞，将这两群细胞提取RNA，PCR分别检测促炎因子IF-1 0，IFN-y的表 达，抑炎因子IL-10的表达。（2)将（1)中分选出的两群细胞分别与人主动脉内皮细胞共 培养。将共培养后的内皮细胞提取RNA，用PCR测定内皮标志物CD31以及炎性因子ICAM1、 VCAM1的表达。（3)按照（2)中方案共培养，共培养的内皮细胞进行划痕实验，测定共培养 前、后内皮细胞迀移的距离。
[0015] 本发明所述的健康人指的是非主动脉瘤患者。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0017] 本发明首次阐明了⑶248在主动脉瘤患者和对照组中的表达差异。⑶248作为一 个肿瘤相关标志物，在炎性区域以及肿瘤新生血管中表达水平较高。人主动脉瘤虽涉及血 管的增生，但有关CD248在人主动脉瘤中的表达情况以及所发挥的作用尚未见报道。
[0018] 人主动脉瘤的发病机制非常复杂，除染色体缺陷所致的马凡氏综合征之外，可 能涉及血流动力学变化、透壁炎症反应等，但具体发病机制尚无定论。本发明通过将 CD248+/-CD8+T细胞与人主动脉内皮细胞共培养，并检测炎性的表达情况，从血管增生、炎 症浸润以等方面，首次系统阐述了 C248在该疾病病变过程中的作用。
【附图说明】
[0019] 图1 :A.流式细胞分析显示升主动脉瘤患者外周血中⑶248+细胞数目明显降低。 B.流式细胞分析显示部分⑶248+细胞定位于⑶3+⑶8+T细胞上。C. PCR结果显示主动脉 瘤病人外周血中⑶248表达降低。
[0020] 图2 :PCR结果显示主动脉瘤病人组织局部的⑶248表达明显升高。
[0021] 图3 :与CD248-CD8+T细胞相比，CD248+CD8+T细胞的促炎因子IF-10，IFN-y等 表达降低，抑炎因子IL-10表达升高。
[0022] 图4 :与对照组相比，⑶248-⑶8+T细胞可使人主动脉内皮细胞的ICAM1、VCAM1表 达升高，而⑶248+⑶8+T细胞可使其表达降低。
[0023] 图5:人主动脉内皮细胞划痕实验显示，⑶248+⑶8+T细胞可显著抑制内皮细胞的 迀移
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0025] 实施例1
[0026] 1.检测主动脉瘤患者外周血中⑶248的表达变化及细胞定位：
[0027] 流式细胞术检测：分别收集对照组（健康人，来源为门诊体检病人，皆为非主动脉 瘤患者）和主动脉瘤组患者的外周血（对照组10例，主动脉瘤组12例，每例抽2ml外周 血），用f icoll (Biosera，LM-T1702/500,法国）分离液，按照说明书步骤采用密度梯度离心 法分离得到单个核细胞，用PBS缓冲液（pH = 7. 2)以及staining buffer (用等体积的1 % 85八和0.02%￡0了六(51§&11^，60004，美国）配制）洗涤，再用1%85六(51 §11^，六1933，美国） 封闭，加入0. 5 y 1兔抗人CD248抗体（abeam，ab67273,英国），4°C孵育30mins，用PBS缓 冲液洗涤后，加入〇.5yl抗兔647荧光二抗（life technology，A-31573,美国）以及lyl 抗人CD8-FITC流式抗体（BD，555634,美国）和1 y 1抗人CD3-PE流式抗体（BD，555333,美 国），4°C避光孵育30mins后用PBS缓冲液洗涤、用PBS缓冲液重悬后上机，用流式分选仪 (BD FACSArial，美国）分别收集⑶248+⑶8+T细胞亚群以及⑶248-⑶8+T细胞亚群。
[0028] PCR方法检测：分别收集对照组（健康人，来源为门诊体检病人，皆为非主动脉 瘤患者）和主动脉瘤组患者的外周血各2ml，用ficoll(Biosera，LM-T1702/500,法国） 分离液，按照说明书步骤采用密度梯度离心法分离得到单个核细胞，用trizol (Takara， A9006-1，日本）提取 RNA，反转录（Promega，017317,美国）为 cDNA 后 PCR(App