用于检测维生素d的组合物和方法
【专利说明】用于检测维生素D的组合物和方法
【背景技术】
[0001] 本发明涉及用于在怀疑含有维生素D的样品中测定维生素D的存在和/或量的组 合物、方法和试剂盒，所述维生素D包括维生素D类似物和其代谢物。
[0002] 术语"维生素D"表示一类脂溶性开环留类化合物。在人体中，维生素D是独特的， 因为其可以以胆钙化留醇（维生素〇 3)或麦角钙化留醇（维生素％)的形式被摄取，以及因 为人体也可以在日照充足时（由胆留醇）合成维生素D。由于此后一性能，一些人认为维生 素D是非必要膳食维生素，但大多数人认为其是必要营养素。维生素D在钙离子体内平衡 的正调节方面具有重要的生理作用。维生素仏是由动物合成的维生素形式。维生素0 2也 是乳制品和某些食品中添加的常见补充剂。
[0003] 膳食和体内合成的维生素仏都必须经历代谢活化来产生生物活性代谢物。在人 体中，维生素D 3活化的初始步骤主要在肝脏中发生，涉及羟基化以形成中间代谢物25-羟 基胆钙化留醇（也被称为钙二醇、骨化二醇、25-羟胆钙化留醇、或25-羟基维生素D 3)。钙 二醇是维生素D3在循环系统中的主要形式。维生素D 2也经历相似的代谢活化为25-羟基 维生素D2。这些化合物共同地被称作25-羟基维生素D (缩写为25 (0H)D)，它们是在血清 中测量来确定维生素D状态的主要代谢物。
[0004] 分析生物样品中的维生素D水平是重要的，因为维生素D缺乏与哺乳动物中的一 些病症有关。需要用于精确和敏感地测定样品中维生素D、维生素D类似物和其代谢物的浓 度的试剂和方法。
【发明内容】
[0005] 符合本文中所述原则的一些实施例涉及下式的化合物：
其中： Z为具有1至10个碳原子的烷基、烯基或炔基，所述碳原子可以是未取代的或其中一个 或多个可以被一个或多个羟基、低级烷氧基、氧代和肟取代； R为-0-琥珀酰亚胺基、-NH-O- (A) k-R2,其中R2为信号产生体系的成员、-(CH 2) nC00H、_(CH2)mC00NHS (NHS为N-羟基琥珀酰亚胺）、小分子、小分子的结合配偶体、或载体； A为连接基团；k为0或1 ;n为1至5的整数，和m为1至5的整数；和 R4为H、0H或低级烷氧基。
[0006] 符合本文中所述原则的一些实施例涉及下式的化合物：
或下式的化合物：
其中： R'为-0-琥珀酰亚胺基或-NH-〇-(A)k-R2,其中R 2为信号产生体系的成员、_(CH2) nCOOH、-(CH2)mCOONHS (NHS为N-羟基琥珀酰亚胺）、小分子、小分子的结合配偶体、或载体； 当k为0时，A为直接键，当k为1时，A为连接基团；k为0或1 ;n为1至5的整数，m为1 至5的整数； R1为H，OH，或受保护的0H;和 R4为H，0H或低级烷氧基。
[0007] 符合本文中所述原则的一些实施例涉及下式的化合物：
或下式的化合物：
其中： L选自磁性颗粒，叮啶酯，磁性颗粒和吖啶酯的组合，化学发光颗粒和增敏剂颗粒；和 R1'为0H，和A'为键或连接基团。
[0008] 符合本文中所述原则的一些实施例涉及在怀疑含有维生素D的样品中测定维生 素D的存在和/或量的方法。在该方法中，提供培养基中的组合物，其包含样品、如上所述 的化合物和维生素D的特异性结合成员。在符合本文中所述原则的一些实施例中，作为样 品的预处理或者在分析培养基中包括用于使维生素D从内源性结合物质中释放的释放剂。 对该组合物施以使该化合物与特异性结合成员结合以形成复合物的条件。测量所述复合物 的量，其中所述复合物的量与样品中维生素D的存在和/或量有关。
[0009] 符合本文中所述原则的一些实施例涉及在怀疑含有维生素D的样品中测定维生 素D的存在和/或量的方法。提供一种组合物，其包含样品，维生素D的特异性结合成员和 下式的化合物：
或下式的化合物：
其中： R' '为-NH-O-A' ' -R2'，其中R2'为信号产生体系的成员，和A' '为键或连接基团，和 R1''为 H 或 0H。
[0010] 任选地，还包括释放剂。对该组合物施以使该化合物与特异性结合成员结合以形 成复合物的条件，并测量该复合物的量。所述复合物的量与样品中维生素D的存在和/或 量有关。
[0011] 附图简沐 图1为根据符合本文中所述原则的实施例合成化合物的示意图。
[0012] 图2为根据符合本文中所述原则的实施例合成化合物的示意图。
[0013] 具体实施方案的详细说明 化合物 如上所述，符合本文中所述原则的一些实施例涉及下式的化合物：
其中： Z为具有例如1至10,或1至9,或1至8,或1至7,或1至6,或1至5,或1至4,或1 至3,或1至2,或2至10,或2至9,或2至8,或2至7,或2至6,或2至5,或2至4,或2 至3,或3至10,或3至9,或3至8,或3至7,或3至6,或3至5,或3至4,或4至10,或4 至9,或4至8,或4至7,或4至6,或4至5,或5至10,或5至9,或5至8,或5至7,或5 至6,或6至10,或6至9,或6至8,或6至7,或7至10,或7至9,或7至8,或8至10,或 8至9,或9至10个碳原子的烷基、烯基或炔基，所述碳原子可以是未取代的，或其中一个或 多个可以被一个或多个羟基、1至5,或1至4,或1至3,或1至2,或2至5,或2至4,或2 至3,或3至5,或3至4,或4至5个碳原子的烷氧基、氧代、或肟取代；和 R为-0-琥珀酰亚胺基或-NH-0- (A) k-R2, R2为信号产生体系的成员、-(CH 2) nC00H、_(CH2)mC00NHS (NHS为N-羟基琥珀酰亚胺）、小分子、小分子的结合配偶体、或载体； 且当k为0时，A为键，当k为1时，A为连接基团；k为0或1 ;n为1至5,或1至4,或1至 3,或1至2,或2至5,或2至4,或2至3,或3至5,或3至4,或4至5的整数，m为1至5， 或1至4,或1至3,或1至2,或2至5,或2至4,或2至3,或3至5,或3至4,或4至5的 整数；和 R4为H、0H或低级烷氧基。
[0014] 术语"烷基"包括直链、支链，或环状构造的具有指定碳原子数的那些烷基。"烷基" 的实例包括但不限于例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲-丁基和叔-丁基、戊基、己基、 庚基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、降冰片基。
[0015] 术语"烯基"包括直链-或支链-构造的具有指定碳原子数和至少一个碳-碳双键 的烃链，所述碳-碳双键可以出现在沿着链的任何位点，其实例包括但不限于例如乙烯基、 丙條基、丁條基、戊條基、^甲基戊條基。
[0016] 术语"炔基"表示含有至少一个碳-碳三键的具有指定碳原子数的直链或支链烃， 其包括但不限于例如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1- 丁炔基、和2- 丁炔基。
[0017] 术语"烷氧基"包括直链、支链或环状构造的具有指定碳原子数的烷基，其中该烷 基包括醚氧来连接母体化合物。
[0018] 在符合本文中所述原则的一些实施例中，连接基团A具有例如低于约2000,或低 于约1500,或低于约1000,或低于约500,或低于约300,或低于约200,或低于约150的分 子量。该连接基团可以包含约2至约200个原子，或4至约150个原子，或约5至约100个 原子，或约5至约50个原子，或约5至约25个原子，不计算氢，和可以包含例如2至约100 个原子，或3至约90个原子，或约4至约80个原子，或约5至约70个原子，或约10至约50 个原子，或约10至约25个原子，或约5至约20个原子，或约5至约10个原子的链，各自独 立地选自碳、氧、硫、氮和磷。连接基团中的杂原子数取决于连接基团的尺寸，在一些实施例 中，该数为例如〇至约30,或1至约25,或约2至约20,或约2至约15,或约2至约10,或约 3至约10,或约3至约5。
[0019] 所述杂原子可以为一个或多个官能团的形式，其包括但不限于例如一个或多个胺 (伯胺、仲胺或叔胺）、氨基甲酸酯、醚、酯、酰胺、脲、磺酰胺、硫醚、腙、酰肼、脒和磷酸酯。在 符合本文中所述原则的一个实施例中，所述连接基团包含仲胺官能团形式的两个氮原子和 约6至约20,或约6至约15,或约6至约10,或约7至约20,或约7至约15,或约7至约10， 或约7至约9,或约7至约8,或约7个原子的链中的一个羰基，原子数包括碳原子。
[0020] 在符合本文中所述原则的一些实施例中，连接基团为大分子，且可以为聚合物大 分子。所述聚合物大分子长度通常为约1至约10, 〇〇〇个单体单元或更多，或约10至约 10, 000个单体单元，或约100至约10, 000个单体单元，或约500至约10, 000个单体单元， 或约1，000至约10, 000个单体单元，或约2, 000至约10, 000个单体单元，或约3, 000至约 10, 000个单体单元，或约5, 000至约10, 000个单体单元，或约10至约8, 000个单体单元， 或约100至约8, 000个单体单元，或约1，000至约8, 000个单体单元，或约100至约7, 000 个单体单元等。单体单元的数量取决于单体单元链中的原子数，单体单元的组成等。
[0021] 聚合物大分子的分子量为至少约2, 000。分子量可以为约2, 000至约10, 000, 000 或更多，或约2, 000至约8, 000, 000,或约2, 000至约6, 000, 000,或约2, 000至约 5, 000, 000,或约 2, 000 至约 4, 000, 000,或约 2, 000 至约 3, 000, 000,或约 2, 000 至约 2, 000, 000,或约 2, 000 至约 1，000, 000,或约 5, 000 至约 10, 000, 000 或更多，或约 5, 000 至约 8, 000, 000,或约 5, 000 至约 6, 000, 000,或约 5, 000 至约 5, 000, 000,或约 5, 000 至 约 4, 000, 000,或约 5, 000 至约 3, 000, 000,或约 5, 000 至约 2, 000, 000,或约 5, 000 至约 1，000, 000,或约 10, 000 至约 10, 000, 000 或更多，或约 10, 000 至约 8, 000, 000,或约 10, 000 至约 6, 000, 000,或约 10, 000 至约 5, 000, 000,或约 10, 000 至约 4, 000, 000,或约 10, 000 至 约 3, 000, 000,或约 10, 000 至约 2, 000, 000,或约 10, 000 至约 1，000, 000 等。
[0022] 聚合物大分子可以为线性或支化或其组合。线性聚合物包含原子的直链，支化聚 合物包含原子的支链。直链的各原子可以具有一个或多个代替氢的取代基。在一些实施方 案中，聚合物可以为包含多于一类单体单元的共聚物。在一些实施方案中，聚合物大分子的 一种或多种单体单元包含碳原子和一个或多个杂原子例如，举例来说氧、硫、氮、磷等。
[0023] 聚合物大分子可以为天然存在的材料或合成构建体。在一些实施方案中，聚合物 大分子为多肽。通过说明并非限制，天然存在的多肽的实例包括蛋白质例如，举例来说白蛋 白和球蛋白，其可以来自人类或其它动物源。白蛋白包括例如人血清白蛋白和牛血清白蛋 白。球蛋白包括例如丙种球蛋白和免疫球蛋白。通过说明而非限制的方式，其它聚合物大 分子的实例包括树枝状大分子、羧酸聚合物（例如，聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚半乳糖醛酸、 聚甲基丙烯酸等）、胺聚合物（例如，聚乙烯胺、聚赖氨酸、聚谷氨酰胺、聚乙烯亚胺、聚烯丙 胺等），醚聚合物（聚乙二醇或聚环氧乙烷等）、硫醚聚合物（例如，聚乙烯硫醚等）、巯基聚 合物（polymeric sulfhydryl)(例如聚半胱氨酸）等。
[0024] 如上所述，在符合本文中所述原则的一些实施例中，R2可以为信号产生体系的成 员。信号产生体系可以具有一种或多种组分，至少一种组分为标记物。信号产生体系产生与 样品中维生素D的存在有关的信号。信号产生体系包括产生可测量信号所需的所有试剂。 信号产生体系的其它组分可以包括在显影液中，且可以包括但不限于例如基材、增强剂、活 化剂、化学发光化合物、辅因子、抑制剂、清除剂、金属离子、和结合信号产生物质所需的特 异性结合物质。信号产生体系的其它组分可以为例如辅酶，与酶产物反应的物质，其它酶和 催化剂。信号产生体系提供可由外部手段，通过使用电磁辐射，理想地通过目测来检测的信 号。示例性信号产生体系在美国专利号5, 508, 178中描述，将其相关公开内容引入本文作 为参考。
[0025] 术语"标记物"包括聚（氨基酸）标记物和非聚（氨基酸）标记物。术语"聚（氨 基酸）标记物部分"包括属于蛋白质的标记物，例如但不限于例如酶、抗体、肽、和免疫原。 对于标记物蛋白质例如，举例来说酶，分子量范围将为约10, 000至约600, 000,或约10, 000 至约300, 000分子量。每约200, 000分子量的蛋白质，存在通常至少一种符合本文中所述 原则的化合物