凝血反应的评价方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及评价具有凝血因子VIII (FVIII)功能代替活性的物质介导的凝血反 应的方法。另外，本发明涉及包含活化凝血因子XI (FXIa)的用于评价凝血反应的试剂、以 及包含该试剂的用于评价具有凝血因子VIII (FVIII)功能代替活性的物质介导的凝血反 应的试剂盒等。
【背景技术】
[0002] 血友病是凝血因子VIII (FVIII)或凝血因子IX (FIX)先天缺乏或功能不全引起 的出血性疾病。前者称为血友病A，后者称为血友病B。它们的基因都存在于X染色体上， 基因异常通过性连锁隐性遗传传递，因此发病患者中99%以上是男性。已知患病率是出生 男子1万人中大约1人，血友病A与血友病B的比率大约是5:1。
[0003] 血友病患者中主要的出血部位可列举关节内、肌肉内、皮下、口腔内、颅内、消化 道、鼻腔内等。其中关节内反复出血进展为关节障碍、伴有步行困难的血友病性关节病，有 时最终需要关节置换术。因此，是降低血友病患者的QOL的主要原因。
[0004] 血友病的严重程度与血液中FVIII活性或FIX活性密切相关。活性不足1%的患 者归类为重度、活性为1%以上不足5%的患者归类为中度、活性为5%以上不足40%的患者 归类为轻度。占血友病患者约半数的重度患者中，每月出现几次出血症状，这是与中度患者 以及轻度患者相比显著高的频率。因此认为，重度血友病患者中，通过FVIII或FIX补充疗 法将血液中FVIII活性或FIX活性维持在1%以上，对于阻止出血症状出现是有效的（非专 利文献1)。
[0005] 作为相关的出血异常，除血友病、后天性血友病之外，还已知冯维勒布兰德因子 (von Willebrand factor，vWF)功能异常或缺乏引起的冯维勒布兰德病。vWF不仅对于血 小板与血管壁的损伤部位的内皮下组织正常粘附是必须的，对血小板与FVIII形成复合物 保持血液中FVIII水平正常也是必须的。冯维勒布兰德病患者中，这些功能降低，引起止血 功能异常。
[0006] 为了预防和/或治疗血友病患者中的出血，主要应用从血浆纯化或通过基因重组 技术制备的凝血因子。
[0007] 作为监测FVIII等凝血因子的药效的方法，已知活化部分凝血活酶时间 (activated partial thromboplastin time， APTT)、基于 APTT 的一段式凝血法 (APTT-based one-stage coagulation method)、凝血酶生成试验（TGA)等。APTT 和一段 式凝血法长期广泛地用作监测FVIII制剂药效的方法。APTT为下列方法，在被测血浆中加 入APTT试剂后，加入CaCl 2，测定纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白的时间，即至凝固起始的 时间。一段式凝血法为下列方法，将用缓冲液以固定比例稀释的被测血浆加入FVIII缺乏 血浆中，以与APTT相同的方法测定凝固时间，由应用连续稀释的正常血浆代替被测血浆得 到校准曲线求出被测血浆的FVIII活性。TGA为下列试验，应用针对凝血酶的荧光底物，以 酶活性随时间测定凝血反应亢进中生成的凝血酶量（非专利文献2)。TGA中，能够评价从 凝血反应的凝血酶生成起始阶段至凝血反应扩增时的凝血酶生成的一系列凝血反应。进一 步，对用于TGA的凝固起始试剂，报告了以低浓度的磷脂溶液（4 yM)为基础组合低浓度的 组织因子的试剂（非专利文献2)、组合FIXa的试剂（非专利文献3、4)、组合FXII活化剂 (鞣花酸）的试剂（非专利文献5)、组合低浓度的组织因子及FXII活化剂(鞣花酸）的混合 溶液的试剂（非专利文献5)。
[0008] 近年来，发现了与活化凝血因子IX (FIXa)以及第X因子（FX)二者结合、具有代 替FVIII的辅因子功能、即促进FIXa介导的FX活化的功能的功能的双特异性抗体（专利 文献1-3)。但是，该双特异性抗体虽然代替FVIII的功能，其作用表现机制与FVIII的该机 制不完全相同。例如，FVIII仅在由FXa、凝血酶活化后开始显示辅因子活性，但上述双特异 性抗体无需该活化过程显示辅因子活性。因此，现有FVIII的药效监测方法不一定能够适 用。
[0009] 现有技术文献 非专利文献 非专利文献1:AstermarkJ.Haemophilia. 2003 9 (Suppl.l) 32非专利文献2 :PathophysiolHaemostThromb. 2003;33(1):4 非专利文献3: JThrombHaemost. 2011Aug;9(8):1549_55 非专利文献4: JThrombHaemost. 2003May;1 (5): 1005-11 非专利文献5 :IntJHematol. 2009Dec;90(5):576-82 专利文献 专利文献1 :W02005/035756 专利文献2 :W02006/109592 专利文献3 :W02012/067176。
【发明内容】
[0010] 本发明要解决的问题 本发明是鉴于这种状况作出的。本发明的目的是，提供评价具有凝血因子VIII (FVIII) 代替活性的物质在凝血反应中的药效的方法、用于该方法的凝血起始试剂、以及包含该试 剂的试剂盒。
[0011] 解决问题的手段 本发明人为了解决上述问题，以各种止血效果评价方法和各种凝血起始试剂为对象， 尝试构建评价具有凝血因子VIII (FVIII)代替活性的物质介导的凝血反应的方法。结果， 本发明人发现，通过使用包含活化凝血因子XI (FXIa)的凝血起始试剂，以血液样品中凝血 酶生成量为指标，能够以适当灵敏度评价具有凝血因子VIII (FVIII)代替活性的物质在凝 血反应中的效果。另外，本发明人成功地发现了，应用包含活化凝血因子XI (FXIa)的凝血 起始试剂的凝血酶生成试验方法。本发明基于上述发现，涉及以下[1]至[9]。
[0012] [1]评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的凝血反应的方法，其包含步骤 ⑴以及（ii): (i)向包含具有凝血因子VIII代替活性的物质的、从被测者分离的血液来源样品中， 加入包含活化凝血因子XI的凝血起始试剂， (ii)测定步骤（i)得到的血液来源样品的凝血酶生成量。
[0013] [2] [1]中记载的方法，其中具有凝血因子VIII代替活性的物质是与凝血因子IX 或活化凝血因子IX、以及与凝血因子X结合的双特异性抗体。
[0014] [3] [1]或[2]中记载的方法，其中被测者是出血性疾病患者。
[0015] [4] [3]中记载的方法，其中出血性疾病是以凝血因子VIII或活化凝血因子VIII 活性降低或缺乏为原因的疾病。
[0016] [5] [3]或[4]中记载的方法，其中出血性疾病是选自血友病、后天性血友病、以及 冯维勒布兰德因子（vWF)功能异常或缺乏引起的冯维勒布兰德病的疾病。
[0017] [6] [1]至[5]的任一项中记载的方法，其中凝血起始试剂是包含活化凝血因子XI 以及磷脂的试剂。
[0018] [7]用于在[1]至[6]的任一项中记载的方法中使用的凝血起始试剂，其包含活化 凝血因子XI。
[0019] [8] [7]中记载的凝血起始试剂，其进一步包含磷脂。
[0020] [9]用于在[1]至[6]的任一项中记载的方法中使用的试剂盒，其包含[7]或[8] 中记载的凝血起始试剂。
[0021] 发明效果 通过本发明，提供了以血液来源样品的凝血酶生成量为指标评价具有凝血因子VIII 代替活性的物质介导的凝血反应的方法。具有凝血因子VIII代替活性的物质、特别是与凝 血因子IX或活化凝血因子IX、以及凝血因子X结合的双特异性抗体的辅因子活性的表现机 制与凝血因子VIII的该机制不完全相同。因此，用双特异性抗体治疗血友病等出血性疾病 中，广泛应用的药效评价方法不一定能够适用，有可能无法适当评价双特异性抗体的效果。 通过本发明，即使在利用上述双特异性抗体的出血性疾病治疗中，也能准确评价其效果。
[0022] 附图简述 图1示出与活化凝血因子IX以及凝血因子X结合的双特异性抗体之一 hBS23的FVIII 功能代替活性。hBS23在FIXa/FX/磷脂存在下显示FXa产生促进活性。
[0023] 图2示出FVIII缺乏血浆、或具有抑制剂的FVIII缺乏血浆的凝血酶生成试验参 数(峰高度（A)以及ETP(B))中，hBS23以及基因重组人凝血因子VIII (rhFVIII)的效果。 各血浆批次得自确认了重度血友病A (血浆1，2，3)或具有抑制剂的重度血友病A (具有 抑制剂的血浆1，2)的单一供体。抑制剂滴度是，具有抑制剂的血浆1、2分别是292、148贝 提斯达单位（Bethesda units)。在FVIII缺乏血浆以及具有抑制剂的FVIII缺乏血浆中， hBS23在FXIa/磷脂试剂诱导条件下浓度依赖性地增加峰高度（Peak height)以及ETP。
[0024] 实施本发明的方式 本发明涉及评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的凝血反应的方法，其包含 以下步骤（i)以及（ii): (i) 在包含具有凝血因子VIII代替活性的物质的、从被测者分离的血液来源样品中， 加入包含活化凝血因子XI的凝血起始试剂， (ii) 测定步骤（i)得到的血液来源样品的凝血酶生成量。
[0025] 通过使用本发明方法，能够适当评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的 辅因子活性。特别地，与作为凝血因子的药效监测方法的之前广泛使用的利用活化部分凝 血活酶时间（APTT)值的方法、利用包含低浓度组织因子的凝固起始试剂诱导的凝血酶生成 试验比较，认为本发明能够以适当灵敏度监测止血效果。
[0026] 本发明的"评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的凝血反应的方法"可称 为"评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的辅因子活性的方法"。另外，也可称为 "评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的出血性疾病治疗效果的方法"。或者，也可 称为"评价具有凝血因子VIII代替活性的物质介导的出血性疾病的预防效果的方法"。进 一步地，"评价方法"也可表达为"判定方法"、"测定方法"。
[0027] 凝血因子VIII是牵涉凝血的一系列分子之一，被凝血酶或活化凝血因子X活化时 表现辅因子活性，促进活化凝血因子IX介导的凝血因子X活化反应。本发明的具有凝血因 子VIII代替活性的物质在促进活化凝血因子IX介导的凝血因子X活化方面与凝血因子 VIII共通，但在例如不需要凝血酶、活化凝血因子X的活化方面与凝血因子VIII不同。
[0028] 本发明的具有凝血因子VIII代替活性的物质也可称为具有凝血因子VIII样活 性的物质。本发明中"代替凝血因子VIII的功能"意味着，识别凝血因子IX (FIX)或凝 血因子IXa (FIXa)、和凝血因子X (FX)，促进FIXa介导的FX活化(促进FIXa介导的FXa 产生)。FXa产生促