一种犬弓形虫抗体间接elisa检测试剂盒的制作方法

文档序号:9248489阅读:379来源:国知局
一种犬弓形虫抗体间接elisa检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检验检疫技术领域,具体地说设及一种犬弓形虫抗体间接化ISA 检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 弓形虫病是由刚地弓形虫(ToxoplasmagondU)入侵动物的有核细胞而引起的一 种全球性的人兽共患寄生虫病。弓形虫是一种机会致病性寄生虫,在正常人体内不会产生 明显症状,对于免疫系统缺陷的群体或者在免疫抑制的患者(如艾滋病患者、恶性肿瘤患 者及刚接受器官移植的人)危害比较大,常引起严重的器官损害,是其常见的致死病因之 一。弓形虫的发育过程需要两个宿主,猫是唯一的终末宿主;中间宿主分布十分广泛,几乎 包括人类在内的所有温血动物、部分变温动物和一些节肢动物。两个宿主在弓形虫的传播 与感染中都起着重要作用。目前弓形虫尚无特效药对其治疗,也无有效的疫苗进行预防,因 此动物弓形虫感染的监测对于疾病的防控具有重要意义。
[0003] 目前常用的弓形虫诊断方法主要包括病原学、分子生物学和免疫学等方法。其中 病原学方法费时费力,准确性较低;分子生物学包括PCR、DNA探针和基因巧片等技术,该方 法虽然敏感性和特异性高,但其操作过程复杂且仪器设备昂贵;免疫学方法有间接血凝试 验(IHA)、萨宾-费尔德曼染色试验值T)、乳胶凝集试验(LAT)、酶联免疫吸附试验巧LISA) 等。IHA操作简单,对感染时间较长的血清具有较好的敏感性,但对急性感染早期的血清敏 感性差,且致敏红细胞不稳定,重复性差。DT是弓形虫病特有的血清学诊断方法,该方法特 异性强且敏感性高,适用于弓形虫感染的早期诊断。但诊断所用的抗原必须为活虫,安全性 差,因此在我国较少应用。LAT最大的问题是特异性差,经LAT诊断的阳性血清还需做进一 步的血清学试验,延长诊断时间,抑制了此方法的推广与应用。ELISA是上世纪70年代出现 的一种标记免疫检测技术,经过多年来不断的完善和改进,该技术已十分成熟。ELISA操作 简便,不需特殊仪器设备,样品用量少,且具有高敏感性和高特异性,判断结果容易,适合于 大量样本的检测。
[0004] 目前市场上存在多种诊断弓形虫的化ISA诊断试剂盒,质量参差不齐难W选择。 进口弓形虫化ISA诊断试剂盒质量虽好,但是却受到运输条件和价格的限制,很难大量推 广应用。因此制备一种特异、敏感、简便且适合华南本地区的弓形虫诊断试剂盒是有一定必 要的。
[0005] 目前弓形虫化ISA检测所用的抗原多是虫体可溶性抗原,其成分不确定,抗原制 备批次间差别较大,不易标准化。随着分子生物学技术的不断发展,重组抗原W其成分确 定、易标准化、特异性强等优势,在选择弓形虫诊断抗原方面应用越来越广泛。弓形虫隶属 于顶复口原虫,其前端都具有椿状体烟loptry)、微粒体(Microsone)和致密颗粒值ense granule) 3种不同尖端复合体,可分泌S种不同的蛋白。椿状体分泌的椿状体蛋白(rhoptry protein,R(P)与弓形虫入侵宿主细胞有密切的关系。R0P5是弓形虫入侵宿主细胞重要的 毒力因子,在弓形虫强毒株入侵宿主之前将R0P5基因敲除,结果发现弓形虫的毒力完全消 失,因此得出R0P5是弓形虫感染宿主的必需毒力因子。不仅如此,R0P5还具有良好的免疫 原性和免疫保护性,是一种潜在的疫苗制备、诊断候选抗原分子。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是克服现有弓形虫ELISA检测技术的不足,提供一种犬弓形虫抗体 间接ELISA检测试剂盒,本检测试剂盒利用弓形虫R0P5重组蛋白作为包被抗原,为进一步 开发与研究弓形虫化ISA诊断试剂盒奠定基础。
[0007] 本发明的目的通过下述的技术方案实现;一种犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂 盒,所述的检测试剂盒中所用的检测抗原为弓形虫R0P5重组蛋白。
[0008] 所述的弓形虫R0P5重组蛋白是通过W下方法制备而成:
[0009] (1)提取RH株弓形虫的DNA;
[0010] 似根据GenBank中已发表的基因序列设计引物,PCR扩增出弓形虫R0P5基因,引 物序列如下:
[0011]RH株R0P5F;5, -TATAGGATCCATGGCGACGAAGCTCG-3,;(SEQIDNO1);
[0012] RH株R0P5R;5, -TATACTCGAGCTCAAGCGACTGAGGGCG-3,;(SEQIDNO2)。
[0013] 其中,粗体部分序列为酶切位点序列;
[0014] (3)扩增的PCR产物的回收与纯化;
[0015] (4)PCR产物与PMD-18T克隆载体连接,连接产物转入D册a感受态细胞,经过 BamHI和化0I酶切鉴定,筛选阳性克隆进行测序;
[0016] (5)经BamHI和化0I双酶切的R0P5基因片段插入表达载体祀T32a中构建重组 表达质粒祀T32a-R0P5;
[0017] (6)将重组表达质粒祀T32a-R0P5转入化21 〇)E3)感受态细胞中,培养后挑取阳性 质粒,酶切鉴定;
[0018] (7)将鉴定为阳性的克隆菌放入细菌到密度增殖培养基(MDG)中培养,待菌液轻 微混浊时,将菌液接种于自动诱导表达培养基狂YM-5052)中诱导表达;用镶柱纯化重组蛋 白,得重组融合蛋白TgR0P5。
[0019] 步骤(2)所述的PCR扩增条件为;94 °C预变性4min,94 °C变性Imin,6rC复性 lmin,72°C延伸2min,进行30个循环,最后72°C终延伸7min。
[0020] 上述的犬弓形虫抗体间接化ISA检测试剂盒,还包括:
[0021] 1)辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG;
[0022] 。磯酸盐缓冲液为 15mMPBS;具体为化Cl8.Og,KH2PO4O. 2g,化2册〇4? 12&0 2. 9g,KC1 0. 2g,加蒸馈水定容至1000血,调节溶液的抑值至7. 4 ;
[0023] 3)抗原包被液为50mMTris盐酸缓冲液巧OmMTBS);具体为Tris0.60g,化C1 0. 88g,加去离子水90mU完全溶解后用盐酸调节抑至7. 6,加去离子水定容至100ml ;
[0024] 4)洗漆液为15mMPBST;具体为含有0. 05%Tween-20的磯酸盐缓冲液;
[0025]W样品稀释液为1%BSA-PBST;具体为BSAIg加入100血PBST;
[002引 6)封闭液为5 %脱脂奶粉;具体为5g脱脂奶粉加入100血PBS;
[0027] 7)酶标二抗稀释液为10 %胎牛血清-PBST;具体为胎牛血清10血加入90血 PBST;
[002引8)底物缓冲液为磯酸盐-巧樣酸缓冲液(p册.0);具体为巧樣酸2. 553g化2册04? 12&0 9. 2g用去离子水定容至500mL,4°C保存;
[0029] 9)TMB贬存液(lOmg/血);具体为TMBlg,DMS0 99血,溶解后分装,4°C避光保存;
[0030] 10)TMB底物显色液;具体为底物缓冲液99血,TMB贬存液1血,30% &〇21〇〇yL,现 配现用;
[0031] 11)终止液(2MH2SO4);具体为浓硫酸21. 7血,去离子水178. 3血,将浓硫酸缓慢加 入去离子水中,边加边揽拌。
[0032] 应用上述试剂盒进行犬弓形虫抗体间接化ISA检测的方法,包括W下步骤:包被 抗原、封闭、加样、加酶标二抗、显色、终止。
[0033] 上述的犬弓形虫抗体间接化ISA检测的方法,最佳的工作条件为:抗原稀释320倍 (浓度为1-25yg/mL),样品稀释50倍,酶标二抗稀释浓度为1:2000,抗原包被时间1.化, 抗原包被液是50mMTris盐酸缓冲液,封闭时间是比,封闭液为5%脱脂奶粉,样品稀释液 为1%BSA-PBST,样品解育时间是2.化,酶标二抗稀释液为10%胎牛血清-PBST,酶标二抗 解育时间是30min,底物显色时间lOmin,阴阳临界值为0. 484。
[0034] 上述的犬弓形虫抗体间接化ISA检测的方法,具体包括W下步骤:
[003引a.包被;用50mMTris盐酸缓冲液将TgROPS重组蛋白稀释成1-25yg/血,包被ELISA酶标板,100yL/孔,37°C解育1.化,甩干包被液,用洗漆液PBST洗漆3次,2min/次; [003引b.封闭;将每孔加300化封闭液5%脱脂奶粉,37°C解育比,甩干封闭液,用PBST 洗漆3次,2min/次;
[0037]C.加检测血清;将血清用1 %BSA-PBST按1:50的比例稀释,设阴性和阳性对照, 每孔加入100y以37°C解育2. 5h,甩干,洗漆3次;
[0038]d.加二抗:用10%胎牛血清-PBST将兔抗犬IgG-HRP作1:2000稀释,100yL/孔, 37°C解育30min,甩干,同上洗漆3次;
[0039]e.加底物:每孔加入100yL新鲜配制的TMB底物溶液,于37°C避光显色lOmin;
[0040]f.终止;每孔50yL加入终止液,终止反应;
[0041]g.结果判定;用酶标仪测450皿处的0D值;0D值> 0. 484为阳性,0D值< 0. 484 为阴性。
[004引上述的犬弓形虫抗体间接化ISA检测原理图如图7所示。
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