用于鉴定钩状效应和扩大及时现场护理免疫测定的动态范围的设备和方法
【专利说明】用于鉴定钩状效应和扩大及时现场护理免疫测定的动态范 围的设备和方法
[0001] 优先权声明
[0002] 本申请要求2012年12月28日递交的美国临时申请61/746705的优先权，将其全 部内容通过引用并入本文。 发明领域
[0003] 本发明设及分析检测设备和使用其的方法。具体地，本发明设及用于快速原位测 定钩状效应的存在和扩大免疫测定特别是及时现场护理免疫测定的动态范围的系统、设备 和方法。
[0004] 发明背景
[0005] 许多针对目标分析物的实验室测试因诊断、筛查、疾病分期、法医分析、妊娠测试、 药物检测W及其它原因而在生物样品上进行。虽然少数定性测试例如妊娠测试已被简化至 用于患者的家庭使用的简单试剂盒，但大部分的定量测试仍需要受过训练的技术人员在实 验室环境中使用复杂仪器的专业知识。实验室测试增加了分析成本并且延迟结果。在许多 情况下，延迟对于患者的病况或预后可是不利的，例如指示屯、肌梗死的标志物的分析。在该 些至关重要的W及其它的情形下，将有利的是能够在及时现场护理准确、廉价并且在最小 的延迟和确保不存在钩状效应的情况下进行该样的分析。
[0006] 钩状效应（也称为前带效应）可在当足够高的祀分析物浓度的存在于被测试的样 品中时出现在夹屯、免疫测定中。具体地，高浓度的祀分析物可导致免疫测定中基本上所有 的信号抗体结合样品中的游离分析物，从而剩下不足量的信号抗体来结合与免疫测定的不 或抗体结合的分析物。因此，例如在免疫传感器上得到的测量信号较低，该指示样品存在少 量的分析物。然而，实际上，分析物浓度是非常高的。术语"钩状效应"来自于该样的观察： 虽然对于分析物响应的信号起初例如W准线性的方式增加，但该信号非期望地达到稳定阶 段并随后W钩状的方式下降。
[0007] 尽管许多参考资料公开了用于检测钩状效应的存在和改善在免疫测定中的影响 的方法和系统，但仍需要用于确保钩状效应在免疫测定中的不存在的改进的系统和方法。 特别是，仍然需要用于确保钩状效应在期望用于在中屯、实验室之外例如在患者及时现场护 理使用的免疫测定系统和方法中的不存在的改进的系统和方法。因此，存在对于改善钩状 效应对及时现场护理分析测试系统的影响的需要。
[000引发明概述
[0009] 在一个实施方案中，本发明设及用于鉴定免疫测定中的钩状效应的装置或系统。 所述装置包括包含第一固定抗体的主传感器，所述固定抗体被配置为基于样品中祀分析物 的存在或不存在产生第一信号。所述装置还包括减弱的传感器，所述减弱的传感器W相对 于主传感器上的第一固定抗体的浓度减少的浓度包含第二固定抗体，并且被配置为基于样 品中祀分析物的存在或不存在产生第二信号。所述装置还包括被配置为基于第一和第二信 号的相对值确定钩状效应在免疫测定中的存在的处理器。
[0010] 在一些方面，第一和第二固定抗体可固定在微粒上。所述微粒可被吸附在主传感 器和减弱的传感器上。在一些实施方案中，被吸附在减弱的传感器上的微粒可包含第二固 定抗体和共吸附物，并且被吸附在主传感器上的微粒可不包含共吸附物。所述共吸附物稀 释被吸附在减弱的传感器上的微粒上的第二固定抗体的表面活性。
[0011] 在一些实施方案中，装置还包括至少一种另外的传感器，所述传感器W相对于分 别地主传感器和减弱的传感器上的第一和第二固定抗体的浓度不同的浓度包含第=固定 抗体，并且被配置为基于样品中祀分析物的存在或不存在产生第=信号。处理器进一步被 配置为基于钩状效应的存在和第一、第二和第=信号的相对值确定祀分析物的浓度。
[0012] 在另一个实施方案中，本发明设及用于鉴定免疫测定中的钩状效应的免疫传感器 装置。所述装置包括包含第一固定抗体的主免疫传感器，所述第一固定抗体被配制为基于 第一固定抗体、祀分析物和标记抗体之间的夹屯、产生第一信号。所述装置还包括减弱的免 疫传感器，所述减弱的免疫传感器W相对于主免疫传感器上第一固定抗体的浓度减少的浓 度包含第二固定抗体，并且被配置为基于第二固定抗体、祀分析物和标记抗体之间的夹屯、 产生第二信号。所述装置还包括被配置为基于第一和第二信号的相对值确定钩状效应在免 疫测定中的存在的处理器。
[0013] 在一些实施方案中，标记抗体可用碱性磯酸酶（AL巧进行标记，并且第一和第二 信号可分别地在主免疫传感器和减弱的免疫传感器上从具有被ALP切割的磯酸盐部分的 电活性物质产生。
[0014] 在一些方面，主免疫传感器和减弱的免疫传感器可被置入一次性盒中，所述一次 性盒被配置为进行免疫测定W确定样品中祀分析物的存在。祀分析物任选可选自肌巧蛋白 I，肌巧蛋白T，屯、肌带肌酸激酶（CKMB)，原降巧素，0-人绒毛膜促性腺激素化HCG)，人绒毛 膜促性腺激素（HCG)，N-末端脑钢肤前体（NTproBNP)，脑钢肤前体（proBNP)，脑钢肤炬NP)， 肌红蛋白，甲状旁腺素，d-二聚体，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL)，半乳糖凝 集素-3W及前列腺特异性抗原（PSA)。
[0015] 在另一个实施方案中，本发明设及包括多个免疫传感器的免疫传感器装置。所述 多个免疫传感器中的每个免疫传感器包括不同浓度的特定于目标分析物的固定抗体，并且 每个免疫传感器被配置为基于固定抗体、木办法行为和标记抗体之间的夹屯、产生信号。所 述装置还包括被配置为基于每个所产生的信号的相对值确定钩状效应在免疫测定中的存 在的处理器。
[0016] 在一些方面，处理器可进一步被配置为基于钩状效应的存在和每个所产生的信号 的相对值确定目标分析物的浓度。
[0017] 在另一个实施方案中，本发明设及用于鉴定免疫测定中的钩状效应的方法。所述 方法包括提供样品至包含第一固定抗体的主传感器，基于样品中目标分析物的存在或不存 在从所述主传感器产生第一信号，和提供所述样品至包含第二固定抗体的减弱的传感器， 所述第二固定抗体W相对于主传感器上的第一固定抗体的浓度减少的浓度提供。所述方法 还包括基于样品中祀分析物的存在或不存在从减弱的传感器产生第二信号，基于第一和第 二信号的相对值确定第一和第二信号的比率，W及基于所确定的比率确定免疫测定中钩状 效应的存在或不存在。
[0018] 在另一个实施方案中，本发明设及将减弱的免疫传感器用于鉴定针对目标分析物 的免疫测定中的钩状效应的方法。所述方法包括施加样品至包含第一固定抗体的主免疫传 感器，基于第一固定抗体、祀分析物和标记抗体之间的夹屯、从所述主免疫传感器产生第一 信号，和施加所述样品至包含第二固定抗体的减弱的免疫传感器，所述第二固定抗体W相 对于主免疫传感器上的第一固定抗体的浓度减少的浓度提供。所述方法还包括基于第一固 定抗体、祀分析物和标记抗体之间的夹屯、从减弱的免疫传感器产生第二信号，计算第一和 第二信号的相对值，基于第一和第二信号的相对值确定第一和第二信号的比率，W及基于 所确定的比率确定免疫测定中钩状效应的存在或不存在。
[0019] 附图简述
[0020] 本发明将根据下述非限制性附图更好地理解，其中：
[0021] 图1示出根据本发明的一些方面的主传感器和减弱的传感器的操作原理；
[0022] 图2显示根据本发明的一些方面的免疫传感器的制造的侧视图；
[0023] 图3显示根据本发明的一些方面的电导测定和免疫传感器电极的掩模设计的俯 视图；
[0024] 图4示出根据本发明的一些方面的钩状效应的存在；
[00巧]图5示出根据本发明的一些方面的从被设计来检测/定量0 -人绒毛膜促性腺激 素化HCG)的测定盒产生的延长范围的剂量-响应曲线；
[0026] 图6显示根据本发明的一些方面的一次性传感装置和读数装置的等距视图；
[0027] 图7显示根据本发明的一些方面的免疫传感器盒盖的等距俯视图；
[0028] 图8显示根据本发明的一些方面的免疫传感器盒盖的等距仰视图；
[0029] 图9显示根据本发明的一些方面的磁带垫片（tapegasket)的俯视图；
[0030] 图10显示根据本发明的一些方面的免疫传感器盒基座的等距俯视图；
[0031] 图11显示根据本发明的一些方面的免疫传感器盒的布局的示意图；
[0032] 图12显示根据本发明的一些方面的免疫传感器盒中的流体和空气路径的示意 图；
[0033] 图13A-13E显示根据本发明的一些方面的W密封形式的免疫传感器盒的俯视图、 仰视图、侧视图和透视图；
[0034] 图14显示根据本发明的一些方面的使用HCG和HCG-反应性安培免疫传感器获得 的剂量-响应结果；
[0035] 图15显示根据本发明的一些方面的HCG-反应性安培免疫传感器对增加的HCG的 响应的良好灵敏度；
[0036] 图16示出根据本发明的一些方面的针对在广泛浓度范围上测定的任意分析物的 来自双传感器布置的概念浓度剂量-响应；
[0037] 图17示出根据本发明的一些方面的使用传感器响应比作为用于检测钩状效应和 扩大测定的动态范围的工具；和
[003引图18、19和20示出根据本发明的一些方面的使用S种不同的"减弱"参照试剂的 前列腺特异性抗原测定的数据。
[00測发明详述
[0040]
[0041] 本发明总体来说设及免疫测定技术并且设及用于允许调节信号响应函数的免疫 传感器的抗体试剂的灵敏度减弱。更具体地，本发明设及及时现场护理免疫测定技术并且 设及用于印记在传感器上的抗体涂覆的微粒试剂中的灵敏度减弱从而允许调节信号响应 函数。本发明的优选实施方案可使用被配置为用作免疫测定中的钩状效应的检测器的至少 一种分析物检测传感器（例如主免疫传感器）和至少一种减弱的传感器（例如减弱的免疫 传感器）来实现。根据优选的实施方案，该样的系统、装置和方法还可被用来扩大免疫测定 的线性动态范围。
[0042] 本发明的一些方面被配置用于使用盒优选一次性盒来快速原位测定分析物，所述 盒具有传感器阵列（例如包括主传感器和减弱的传感器的免疫传感器对）和用于连续地或 基本上连续地呈递样品和流体（修正或未修正的）至传感器阵列的工具。所述盒可被配 置为优选与读数装置一起操作，例如在美国专利No. 5, 096, 669、美国专利No. 5, 821，399和 7, 419, 821 (其通过引用W其整体并入本文）中公开的读数装置。按照本发明的该些方面使 用的盒与读数装置的细节将在下文进一步详细描述。
[0043] 因此本发明的一个实施方案提供了具有样品保持室的单次使用或一次性盒，所述 样品保持室连接至包含主传感器和减弱的传感器的第一管道。部分含有流体（任选来自可 破裂的小袋）的第二管道可连接至所述第一管道，并且空气区段可被引入第二管道的流体 中W使所述流体分段。可在所述盒内提供累。所述累可被配置为将样品转移到第一管道内， 并且将第二流体从第二管道转移至第一管道中。由此所述免疫传感器对可首先与样品接触 随后与第二流体接触。
[0044] 在第二实施方案中，使用位于第一管道和废料室之间的可关闭的阀来提供所述 盒。此实施方案允许仅使用连接至第一管道的单个累来将流体从第二管道转移至第一管 道。此实施方案还允许所述盒的第一和第二管道的有效洗漆。在所述盒的操作中，样品可 被转移W接触免疫传感器对，并随后可通过可关闭的阀被转移至废料室。在通过样品浸湿 可关闭的阀后，所述可关闭的阀密封废料室的开口，从而提供了允许通过使用连接至第一 管道的累来使第二管道中的流体与免疫传感器对进行接触的气密密封。在此实施方案中， 可关闭的阀允许流体进行转移并阻止空气从废料室进入第一管道。
[0045] 在第S实施方案中，提供了可关闭的阀和用于将空气区段引入管道的工具。有利 地，该样的配置提供了在免疫传感器对上互换分段流体的能力。因此，第一空气区段或空气 区段组可被用于促进免疫传感器对的冲洗。随后可将新鲜的空气区段定位于免疫传感器对 之上用于进行测量。在此实施方案，所述盒的操作可仅需要一个累（连接至管道）。
[0046] 在第四实施方案中，分析物测量在涂覆免疫传感器对的液体薄膜中进行。薄膜测 定优选通过电流进行。本实施方案与前述实施方案的不同之处在于具有当样品通过阀排出 时被密封的可关闭的阀和管道内允许将至少一个空气区段随后引入测量流体的排气口。有 利地，此配置可增加从免疫传感器对冲洗样品的效率，并且还可允许在测量前从免疫传感 器对除去基本上所有的流体。更有利地，此配置可允许使新鲜流体区段通过免疫传感器对 W允许连续的重复测量W用于改善准确性和可重复性的内部检查。
[0047] 在优选的实施方案中，用于低浓度的免疫活性分析物的检测的分析方案可依赖于 酶标记夹屯、复合物的形成。样品中分析物的浓度可被转化至成比例的酶表面浓度。所述酶 能够通过将底物转化成可检测的产物来扩增分析物化学信号。例如当碱性磯酸酶（AL巧是 所述酶时，单个酶分子可产生每分钟约九千个可检测的分子，从而相较于其中电活性物质 取代ALP附着至抗体的方案，在分析物的可检测性方面提供数个数量级的改善。
[0048] 在本实施方案中，可有利地首先用样品随后在记录来自传感器的响应之前用洗漆 流体接触免疫传感器对。在具体的实施方案中，样品可用抗体-酶缀合物进行修正，所述抗 体-酶缀合物在经修正的样品接触免疫传感器对之前结合样品内的目标分析物。样品中的 结合反应产生分析物/抗体-酶夹屯、复合物。主免疫传感器可包括针对分析物的固定抗体， 其紧密地附着至电极表面。在接触主免疫传感器后，所述分析物/抗体-酶复合物结合至 电极表面附近的固定抗体。此相同的反应可发生在减弱的免疫传感器（例如钩状效应检测 传感器）上，其可邻近或远离主免疫传感器。
[0049] 在该一点上，可有利的是尽可能多地从电极附近除去未结合的抗体-酶缀合物W 使来自传感器的背景信号最小化。抗体-酶复合物的酶可被配置为将将提供在流体中的底 物转化至产生电化学活性物质。此活性物质可产生在各电极附近，并且当施加合适的电位 时可提供来自电极处的氧化还原反应的电流（电流操作）。可选择地，如果电活性物质是离 子，则可进行电位测量。在电流测量中，电位可在测量过程中是固定的，或根据预定的波形 变化。例如=角波可用来扫描两限之间的电位，如在广为人知的循环伏安法技术中所使用 的。可选择地，数字技术例如方波可用于改善电极附近的电活性物质的检测灵敏度。根据 电流或电压测量，可计算样品中分析物的量或存在。
[0050] 在其中所述盒包含免疫传感器对的实施方案中，免疫传感器可从惰性金属例如 金、销或银的基本传感器和用附着于微粒例如乳胶颗粒的生物活性层覆盖的多孔选择性渗 透层进行微制造。所述微粒可被分配至覆盖电极表面的多孔层，从而形成附着的多孔生物 活性层。所述生物活性层可具有特异性结合目标分析物或在分析物存在时显示可检测的变 化的性质，并且最优选是针对分析物的固定抗体。主要用于分析物的定量的免疫传感器与 减弱的免疫传感器之间的本质区别是捕获抗体或固定抗体的