一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法与应用

文档序号:9260403阅读:1665来源:国知局
一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学检测领域,特别涉及一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法与应用。
【背景技术】
[0002]1975年德国学者Kohler和Milstein发明了杂交瘤技术。他们成功将骨髓瘤细胞和产生抗体的B淋巴细胞融合为杂交瘤细胞,这种合成的杂交瘤细胞可产生只针对某一特定抗原决定簇的单克隆抗体。杂交瘤技术的的创建,开创了抗体制备的新纪元,为临床疾病的诊断、预防和治疗提供了新的工具,促进了免疫学、基础与临床医学等众多学科的发展。
[0003]单克隆抗体具有纯度高、特异性强、效价高、少或无交叉反应等特性,已广泛应用于疾病的诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向制药的制备等。单克隆抗体在理论和实践上的应用,成为解决生物学、医学等诸多重大问题的重要手段。
[0004]尽管单克隆抗体具有重要的作用,可传统的单克隆抗体制备过程中杂交瘤细胞的筛选比较繁琐。融合后的杂交瘤经HAT培养基培养一周后,然后将每个板孔中的细胞上清取出来,通过ELISA检测其是否分泌特异性抗体,是否为分泌能力强的抗体,若检测出为阳性且分泌能力强的细胞,则需要把此阳性细胞至少进行三次亚克隆,才能得到阳性单克隆杂交瘤细胞株。这种方法不仅耗时耗力,还具有以下几个缺点:(I)在多细胞克隆(融合孔)孔筛选时,ELISA方法仅能评价孔内是否含有阳性克隆,不能评价宄竟哪个克隆是阳性克隆;(2)在克隆化过程中,ELISA仅能评价细胞孔内所有细胞分泌抗体后的总体情况,不能直接评价板孔中的细胞变异情况,需经再次克隆化后才能大致反推评价前代原始孔中细胞的变异情况;(3)在再次克隆化过程中,ELISA结合有限稀释法克隆细胞时,仅留下极少量的细胞(50-100个细胞)用于铺板筛选,而大部分的细胞被抛弃了,在这个过程中,由于细胞变异和竞争,强阳性细胞很可能被漏选;(4)单个杂交瘤细胞孔经过数次克隆化后,将产生大量的需处理和检测细胞孔,工作量庞大,琐碎。以上这些因素都不利于阳性细胞株的筛选。

【发明内容】

[0005]本发明首要的目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法。
[0006]本发明的另一目的在于提供所述筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法的应用。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法,包括如下步骤:
[0008](I)将 01eyl-PEG4000-NHS 与抗原偶联,得到 01eyl-PEG4000-NHS_Ag ;
[0009](2)将待筛选的杂交瘤细胞克隆清洗;接着加入01eyl-PEG4000-NHS-Ag,37°C、5% CO2培养;然后弃上清,清洗杂交瘤细胞克隆;
[0010](3)将荧光物质标记的抗鼠二抗加入到步骤(2)处理好的杂交瘤细胞克隆,37°C、5% CO2培养;然后弃上清,清洗杂交瘤细胞克隆;
[0011](4)加入不完全培养基,用倒置荧光显微镜观察可见光和荧光下的细胞团,并拍照做好阴阳性的标记;
[0012](5)在含有阳性细胞团的板孔中加入甲基纤维素半固体培养基,观察位置并做好标记,将阳性标记细胞移入到新的细胞培养板中培养,得到分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞。
[0013]步骤(I)中所述的抗原优选为呋喃唑酮代谢物(AOZ)或肌酸激酶同工酶(CKMB)。
[0014]所述的呋喃唑酮代谢物优选为衍生的CPA0Z。
[0015]步骤(I)中所述的偶联可为常规的偶联方法,当抗原是非完全抗原时,先将01eyl-PEG4000-NHS与载体蛋白偶联,再与抗原偶联;当抗原是完全抗原时,将01eyl-PEG4000-NHS与抗原偶联即可。偶联的具体步骤优选如下:当所述的抗原为呋喃挫酮代谢物,将01eyl-PEG4000-NHS与BSA偶联后,再与呋喃唑酮代谢物衍生物偶联;当所述的抗原为肌酸激酶同工酶,将01eyl-PEG4000-NHS直接与肌酸激酶同工酶直接偶联。
[0016]步骤(2)中所述的01eyl-PEG4000-NHS-Ag的加入量优选为按48孔板的每孔添加
0.0lmg 计算。
[0017]步骤⑵中所述的培养的时间优选为30?90min ;更优选为60min。
[0018]步骤(3)中所述的荧光物质包括异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RB200)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)。
[0019]步骤(3)中所述的抗鼠二抗优选为羊抗鼠IgGFc 二抗。
[0020]步骤(3)中所述的培养的时间优选为30?60min ;更优选为40min。
[0021]步骤(2)和(3)中所述的清洗优选通过磷酸盐缓冲液(PBS)或是不完全培养基进行清洗。
[0022]所述的不完全培养基的组成如下:链霉素和青霉素混合液与RPMI1640培养基按体积比1:99配比混合得到,其中,链霉素和青霉素混合液中,链霉素和青霉素的浓度分别为 lU/mlo
[0023]步骤(5)中所述的甲基纤维素半固体培养基优选为通过如下步骤得到:将RPMI1640培养基和质量体积比2.7%的甲基纤维素溶液按体积比1:1混合均匀,得到甲基纤维素半固体培养基。
[0024]步骤(5)中所述的甲基纤维素半固体培养基的体积用量优选为相当于步骤(4)中所述的不完全培养基的体积的4/3倍。
[0025]所述的筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法在免疫学领域中进行应用,用于快速筛选得到分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞。
[0026]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明通过一种两亲性物质(01eyl-PEG4000-NHS)能够快速简便筛选分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,缩短阳性细胞株的筛选时间,减少克隆化的次数和阳性细胞株的丢失,准确率高。01eyl-PEG4000-NHS是一种两亲性物质,其一端是亲脂性的,能与细胞膜结合,另一端的PEG聚合物是亲水性的,其末端连接的-COO-NHS是经NHS活化过的羧基,可以与抗原上的氨基相结合,细胞克隆化后培养4-5天后,先用不完全培养基洗涤细胞两次,可以把原有的抗体洗去,排除了假阳性;把偶联的特定抗原偶联物加入到相应的细胞,孵育后偶联物的一端连接到细胞膜上,偶联的抗原与分泌的抗体结合,洗去未结合的抗体,加入荧光二抗孵育,洗去未结合的二抗,观察荧光,做好标记,加入甲基纤维素半固体培养基直接挑取有荧光的挑选细胞。直接能挑取阳性细胞,克隆化时不易漏选强阳性细胞株。进行2-3次克隆阳性率就能达到90%以上的,这种方法半个月内就能筛选到阳性细胞株,缩短筛选的时间;可精准评价孔内每个细胞的抗体分泌情况和细胞克隆的变异情况,结合半固体培养基有利于挑选到稳定的阳性细胞株;再次克隆化时不易漏选强阳性细胞株;而常规单克隆筛选一般至少需要一个月才能筛选到阳性细胞株,不能确定阳性克隆,克隆化时容易漏选阳性细胞株。
【附图说明】
[0027]图1 是 01eyl-PEG4000-NHS-BSA-CPA0Z 的 SDS-PAGE 检测结果图;其中,泳道 I 是 Marker,泳道 2 是 01eyl-PEG4000-NHS_BSA,泳道 3 是 BSA,泳道 4 是01eyl-PEG4000-NHS-BSA-CPA0Z。
[0028]图2是01eyl-PEG4000-NHS-BSA-CPA0Z的紫外可见分光扫描检测结果图。
[0029]图3 是 01eyl-PEG4000-NHS-CKMB 的 SDS-PAGE 检测结果图;其中,泳道 I 是 CKMB,泳道 2 是 Marker,泳道 3 是 01eyl-PEG4000-NHS_CKMB。
[0030]图4是01eyl-PEG4000-NHS-CKMB的紫外可见分光扫描检测结果图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
[0032]实施例1
[0033](l)01eyl-PEG4000-NHS与抗原的偶联和鉴定
[0034]I) 01eyl-PEG4000-NHS 与 BSA 的偶联
[0035]称取33mg BSA,溶于3.3mL 15mM、pH 7.4的PBS (下面所用的PBS同此处)中,搅拌器搅拌均匀,得到BSA溶液。接着称取1mg 01eyl-PEG4000-NHS (购买于日本NF公司),溶于ImL PBS,得到01eyl-PEG4000-NHS溶液。将01eyl-PEG4000_NHS溶液缓慢加入到搅拌状态的BSA溶液中,常温下搅拌3小时,得到01eyl-PEG4000-NHS-BSA溶液。
[0036]2) 01eyl-PEG4000-NHS-BSA 与 CPAOZ 的偶联
[0037]①吸取500 μ I 01eyl-PEG4000-NHS-BSA溶液,加入到500 μ I PBS中,置于冰盒中搅拌。
[0038]②将衍生好的CPAOZ (按文献“周克楠等.呋喃唑酮代谢物单克隆抗体及其新型免疫层析检测试纸条的制备[J].中国生物制品学杂志,2014,7:017.”提供的方法制备得到)溶解后缓慢加入步骤①最终得到的的溶液中搅拌过夜,12h后3000rpm、4°C离心5min,取上清,用30KD的超滤管超滤,得到01eyl-PEG4000-NHS-BSA-CPA0Z。再进行过滤除菌,置于4°C保存。
[0039]3) 01eyl-PEG4000-NHS-BSA 和 01eyl-PEG4000-NHS-BSA_CPA0Z 的鉴定
[0040]通过SDS-PAGE和紫外可见分光扫描进行鉴定。SDS-PAGE电泳鉴定(如图1所示)和紫外可见分光扫描鉴定(如图2所示)的结果表明,的确获得01eyl-PEG4000-NHS-BSA和 01eyl-PEG4000-NHS-BSA-CPA0Z。
[0041](2)呋喃唑酮代谢物(AOZ)杂交瘤细胞团的筛选<
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