体外生物瓣钙化评价的方法及抗钙化因子溶液的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物瓣膜领域，具体涉及一种体外生物瓣钙化的评价方法及抗钙化因 子溶液。
【背景技术】
[0002] 目前年龄超过65岁老年人中，由于主动脉瓣钙化所致的主动脉瓣狭窄发生率达 2%~7 %，随着年龄增长主动脉瓣狭窄比例越来越高。严重主动脉瓣狭窄的病人左心功能 严重受损，病人生活质量下降且生存时间明显缩短，必须进行有效的治疗。
[0003] 针对外科手术适应症的严重主动脉瓣病人，外科人工主动脉瓣置换术（无论选用 机械瓣或生物瓣）仍然是首选治疗，置换后主动脉瓣口面积常大于1. 5cm2。然而，对于那些 高龄、主动脉瓣狭窄终末期、全身多发的严重合并症的病人，外科主动脉瓣置换术后死亡和 其它严重并发症的发生率大大增加。经皮球囊主动脉瓣成形术治疗老年主动脉瓣狭窄的方 法，由于术中、手术后产生死亡、中风、主动脉破裂、主动脉瓣严重关闭不全等严重并发症的 发生率高，术后短期（3~12个月）内主动脉瓣又明显狭窄，所以已不作为严重主动脉瓣狭 窄的治疗方法。另外，严重主动脉瓣狭窄的高龄老年病人，无外科手术适应症时，临床治疗 十分困难。
[0004] 现有技术中，在进行动物试验前，选取适龄的猪或者羊，经过医生超声以及健康状 况观察，评价手术风险和匹配度，确定瓣架和主肺动脉口径的吻合度，要求瓣架尺寸与主动 脉或者肺动脉口径相匹配，防止瓣周漏或移位等情况发生。然后根据动物临床的要求开展 动物临床，将经过处理后的生物瓣植入到猪或者羊体内，经超声影像观察瓣膜正常工作，通 过饲养半年到一年的观察期，解剖取出生物瓣后经原子吸收光谱法检测生物瓣组织的含钙 量，从而判定生物瓣的抗钙化性能。
[0005] 通过动物临床来评价生物瓣钙化的方法具有一定的局限性，对临床手术和临床医 生的技术依存度要求高、对动物选择也有相应要求，同时饲养周期长、受饲养环境和个体差 异的影响较大，可能出现其它症状，比如生物瓣表皮化、生长赘生物等，不能准确有效的反 映生物瓣化学处理后与钙离子的化学作用。现有技术方法不仅仅在技术上增加了难度，而 且时间和成本上都大幅的增加，同时在生物瓣的钙化性能评价上，受到多种因素的影响。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种体外物瓣钙 化评价方法，该方法大大缩短了钙化评价周期，是一套高效的标准化评价方法。
[0007] 本发明要解决的另一技术问题是，提供一种抗钙化因子溶液，其通过对生物瓣进 行化学处理，封闭某些游离化学基团，减小生物瓣与钙离子的结合力，从而降低生物瓣的 挂妈量，增强生物瓣膜的抗妈化能力。所述的抗妈化因子英文全称为：ReducingCalcium Ingredient，简称为：RCI。
[0008] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种体外生物瓣钙化评价方 法，包括以下步骤：
[0009] (1)钙化评价液的配制；该钙化评价液包括：戊二醛溶液、生理盐水溶液、硼酸盐 缓冲溶液、抗钙化因子溶液和血浆含钙溶液；
[0010] (2)抗钙化因子溶液预加热：取抗钙化因子溶液于30~40°C的恒温水浴锅中以 5~lOrpm转速温浴18~24h;
[0011] (3)抗钙化前处理：取切割好的瓣膜样品，用戊二醛溶液完全浸泡，室温静置18~ 24h；
[0012] (4)抗钙化因子溶液处理：将抗钙化前处理的液体倒去，倒入硼酸盐缓冲溶液浸 没，去液后用抗钙化因子溶液完全浸泡，在30~40°C的恒温水浴锅中以120~130rpm转速 温浴67~72h;
[0013] (5)瓣膜样品保存：瓣膜样品去液后，倒入生理盐水溶液完全浸泡瓣膜样品，2~ 8°C保存；
[0014] (6)体外钙化反应：取样品放入血浆含钙溶液中，生物瓣与定量的钙离子溶液充 分反应，钙离子通过化学键结合到瓣膜中，30~40°C，120rpm，恒温水浴中反应60天内的任 意一天；
[0015] (7)钙定量检测：分别取任意一天反应后的瓣膜样品进行原子吸收光谱钙含量测 定，与标准对照样进行对比，得到评价瓣膜样品的钙含量。
[0016] 本发明更进一步的方案是：所述的戊二醛溶液浓度为0. 25~5. 0%的戊二醛溶 液，其每配制5L包括的成分及含量为：硫酸镁1. 0~3. 0g;氯化钾1. 0~3. 0g;磷酸氢二 钠3. 0~5. 0g;磷酸二氢钾0? 6~1. 2g;氯化钠15~30g;25%戊二醛150~250ml;异丙 醇500~1000ml;纯水定容到5000ml。
[0017] 本发明更进一步的方案是：所述的生理盐水溶液为0. 9%生理盐水，其每配制10L 包括的成分及含量为：氯化钠90g±0.lg;纯水定容到10L。
[0018] 本发明更进一步的方案是：所述的硼酸盐缓冲溶液配制1L包括的成分及含量为： 氯化钠3. 0~15. 0g;四硼酸钠2. 0~5. 0g;纯水定容到1000ml。
[0019] 本发明更进一步的方案是：所述的抗钙化因子溶液配制1L包括的成分及含量 为：试剂A150~300ml，该试剂A为醇类；试剂B10~100ml，该试剂B为碱溶液；试剂C 0? 5~9. 0g，试剂C为油脂及其衍生物；试剂D690~820ml，pH值8. 5~9. 5,该试剂D为 缓冲溶液。
[0020] 本发明更进一步的方案是：所述的血浆是人工代血浆，其配制1L的成分包括： 10%CaC12溶液10~15ml;羟乙基淀粉氯化钠注射液900~1000ml。
[0021] 本发明更进一步的方案是：所述的试剂A包括乙醇、异丙醇、戊醇中的任意一种。
[0022] 本发明更进一步的方案是：所述的试剂B包括KOH、NaOH中的任意一种。
[0023] 本发明更进一步的方案是：所述的试剂C包括四烯酸、亚油酸、二十碳三烯酸、亚 麻酸、氨基油酸、十二酸、庚酸、软脂酸、硬脂酸、油酸、及其衍生物中的一种或任意几种。
[0024] 本发明更进一步的方案是：所述的试剂D包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或甘 氨酸盐酸缓冲液中的一种，pH值为8. 5~9. 5。
[0025] 本发明的另一技术方案是：一种抗钙化因子溶液，该溶液包括：试剂A、试剂B、试 剂C、试剂D，其中：
[0026] 试剂A为醇类，包括乙醇、异丙醇、戊醇中的任意一种；
[0027] 试剂B为碱溶液，包括KOH、NaOH中的任意一种；
[0028] 试剂C为油脂类及其衍生物，包括四烯酸、亚油酸、二十碳三烯酸、亚麻酸、氨基油 酸、十二酸、庚酸、软脂酸、硬脂酸、油酸、及其衍生物中的一种或任意几种；
[0029] 试剂D为缓冲溶液，包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或甘氨酸盐酸缓冲液中的 一种，pH值为8. 5~9. 5。
[0030] 本发明的有益效果在于，本发明的体外生物瓣钙化评价方法，其评价周期短，同时 减少了工序，节省了评价费用；同时通过抗钙化因子溶液的配合对生物瓣进行化学处理，封 闭某些游离化学基团，减小生物瓣与钙离子的结合力，从而降低生物瓣的挂钙量，增强生物 瓣膜的抗钙化能力；通过本发明的体外生物瓣钙化评价方法，快速有效的判断化学处理后 的生物瓣抗钙化性能。
【具体实施方式】
[0031] 以下对本发明的较佳实施例作详细说明。
[0032] 具体方案如下：
[0033] 1.钙化评价液配制
[0034] 本发明的整个方案中需用到5种溶液，0. 25~5. 0%戊二醛溶液、0. 9%生理盐水 溶液、BBS溶液、RCI溶液、人工代血浆含钙溶液。其成分及含量如下所示：
[0035]
[0036]
[0039] 上述试剂中：
[0040] 试剂A为醇类，包括乙醇、异丙醇、戊醇中的任意一种；
[0041] 试剂B为碱溶液，包括KOH、NaOH中的任意一种；
[0042] 试剂C为油脂类及其衍生物，包括四烯酸、亚油酸、二十碳三烯酸、亚麻酸、氨基油 酸、十二酸、庚酸、软脂酸、硬脂酸、油酸、及其衍生物中的一种或任意几种；
[0043] 试剂D为缓冲溶液，包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或甘氨酸盐酸缓冲液中的 一种，pH值为8. 5~9. 5。
[0044]
[0045] 2.RCI溶液预加热
[0046] 取RCI溶液于30~40°C的恒温水浴锅中以5~lOrpm转速温浴18~24h。
[0047] 此过程主要是对RCI溶液进行预热，让有效成分充分均匀，达到一个稳定有效的 工作环境溶液。
[0048] 3?抗钙化前（PRCI)处理
[0049] 取切割好的瓣膜，放置换于空瓶中，用0. 25~5. 0%戊二醛溶液完全浸泡，室温静 置18~24h。
[0050] 此过程是通过戊二醛浸泡瓣膜，达到饱和过交联的作用，基团充分配对。
[0051] 4.RCI处理
[0052] 将PRCI处理的液体倒去，倒入BBS溶液浸没，晃动清洗一次或数次，去液后用RCI 溶液完全浸泡，在30~40°C的恒温水浴锅中以120~130rpm转速温浴67~72h。
[0053] 此过程是将RCI溶液的化学物质与瓣膜中游离的基团进行化学结合，达到封闭瓣 膜中游离的醛基和羧基的目的。