一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物的制作方法

文档序号:9273736阅读:921来源:国知局
一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤生物标记物领域,具体涉及一组乳腺癌分子亚型的生物标志物的 组合物,该组合物来源于血浆内源性小分子代谢产物,该组合物对于快速区分乳腺癌的分 子亚型和临床个体化治疗具有重要意义。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是女性中最为常见的恶性肿瘤,具有很强的异质性,近年来其发病率和死 亡率均在逐渐增高。乳腺癌患者中人表皮生长因子受体2(HER2)是一种原癌基因,它的 高水平表达提示患者容易出现腋窝淋巴结转移,临床建议使用相应的分子靶向药物进行干 预。雌激素受体(ER)的表达是应用内分泌药物治疗不可或缺的重要依据。根据HER2和ER 的基因表达情况,可将乳腺癌分为4种分子亚型:LuminalA型(ER+、HER2-)、Luminal B型 (ER+、HER2+)、HER2 过表达型(ER-、HER2+)和 Basal-like 型(ER-、HER2-)。
[0003] 确定乳腺癌分子分型是个体化治疗的基础。目前,临床上主要通过活体组织检查 法及后续的免疫组化法研宄癌细胞基因的表达情况来判断乳腺癌的分子分型。但是,该方 法昂贵、耗时,对病人容易造成较大的创伤,且容易误判。
[0004] 因此发展快速、无创的乳腺癌分子分型诊断方法尤为重要。有研宄表明,癌症病人 的基因水平变化会在体内内源性小分子代谢物水平上有所呈现。血浆分析是临床上常用的 一种疾病诊断方法,因其简便、经济且相对无创的优点而被广泛采用。目前尚未有人使用血 浆代谢物水平区分乳腺癌分子分型。
[0005] 因此,应用血浆代谢组学寻找生物标志物以区分乳腺癌分子亚型的研宄策略对于 乳腺癌的临床快速诊断及个体化治疗具有重要意义。

【发明内容】

[0006] 本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物:哌啶酸、缬氨酸在制备区 分乳腺癌亚型生物标志物的组合物的应用。
[0007] 本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物:哌啶酸、缬氨酸、脯氨酸、 异亮氨酸、亮氨酸、2-辛烯二酸在制备区分Luminal B型和HER2过表达型乳腺癌的标志物 的组合物的应用。
[0008] 本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物:
[0009] 分别检测HER2过表达型、Luminal B型患者的离体血浆
[0010] 与HER2过表达型相比,Luminal B型的哌啶酸下调,缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮 氨酸、2-辛烯二酸上调。
[0011] 本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物:
[0012] 单位:提取离子流强度
[0013] 哌啶酸:Luminal B 型 2156672±45553、HER2 过表达型 2198270±79503 ;
[0014] 缬氨酸:Luminal B 型 1368882±182218、HER2 过表达型 1233138±265196 ;
[0015] 脯氨酸:Luminal B 型 1325183±55489、HER2 过表达型 1311271 ±79206 ;
[0016] 异亮氨酸:Luminal B 型 325054±5322、HER2 过表达型 224589±9743 ;
[0017] 亮氨酸:Luminal B 型 2548628±130655、HER2 过表达型 2301808±90442 ;
[0018] 2-辛烯二酸:Luminal B 型 1126470±42105、HER2 过表达型 1109990±70424。
[0019] 本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物:哌啶酸、缬氨酸、甘氨酸、 甘氨鹅去氧胆酸、棕榈酸在制备区分Luminal A型和Basal-like型乳腺癌的标志物的组合 物的应用。
[0020] 本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物:
[0021] 分别检测LuminalA、Basal-like型患者中的离体血衆
[0022] 与Basal-like型相比,Luminal A型患者血衆中结|氨酸含量明显上调,哌啶酸、甘 氨酸、甘氧鹅去氧胆酸及棕榈酸明显下调。
[0023] 本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物:
[0024] 单位:提取离子流强度
[0025] 哌啶酸:LuminalA型 217914±99803、Basal-like型 256884± 119445 ;
[0026] 缬氨酸:LuminalA型 1152199±294556、Basal-like型 892569± 141893 ;
[0027] 甘氨酸:LuminalA型 361960± 164984、Basal-like型 487493± 144298 ;
[0028] 甘氨鹅去氧胆酸:Luminal A 型 19579± 1680、Basal-like 型 27315± 1922 ;
[0029] 棕榈酸:LuminalA型 264688±43895、Basal-like型 292127±35745。
[0030] 本发明采用的技术方案是:应用基于液相色谱质谱联用、气相色谱质谱联用技术 的非靶向代谢组学分析,结合多元数据分析处理方法,开展乳腺癌不同分子亚型患者的血 浆代谢组学研宄,寻找患者血浆中表征乳腺癌分子分型的内源性小分子生物标志物组合。
[0031] 检测患者离体血浆:与HER2过表达型相比,Luminal B型患者血浆中脯氨酸、异亮 氨酸、亮氨酸、2-辛烯二酸及缬氨酸水平明显上调,哌啶酸水平明显下调;与Basal-like型 相比,Luminal A型患者血浆中缬氨酸水平明显上调,哌啶酸、甘氨酸、甘氨鹅去氧胆酸及棕 榈酸水平明显下调。
[0032] 本发明的乳腺癌分子亚型的生物标志物的确定过程如下:
[0033] 材料:乙腈及甲酸(UPLC纯)购于美国ROE公司;色谱级别甲醇和氯仿购于江苏汉 邦科技有限公司;氯化甲氧胺及N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(含1%三甲基氯硅 烧)购于美国Sigma-Aldrich公司;去离子水由美国密理博(Millipore)公司的MIlli-Q超 纯水系统制备;标准化合物包括:2_异丙基苹果酸、谷氨酰胺、脯氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、 苯丙氨酸、副黄嘌呤、维生素C、苹果酸、异亮氨酸、甘氨鹅脱氧胆酸、油酸、亚油酸、Y-亚麻 酸、乳酸、甘氨酸、草酸、亮氨酸、甘油、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、柠檬酸、D-果糖、D-葡萄 糖、棕榈酸、硬脂酸及胆固醇,均购于美国Sigma-Aldrich公司。
[0034] 血浆标本采集:96例乳腺癌患者术前外周静脉血内的血浆和年龄、性别与实验组 相匹配的79例健康志愿者的外周静脉血的血浆。所有的实验者均有正常的心肺肝肾及造 血功能,米血时间均为清晨空腹状态。
[0035] 血浆样品提取溶剂的优选过程:
[0036] UPLC-Q/TOF-MS血浆样品提取溶剂优化:利用响应面法进行实验设计,以质谱 ESI+和ESI-检测模式下的峰个数和总峰面积为标准考察不同溶剂(乙腈、甲醇、乙醇、氯 仿、水),对血浆标本的提取效率。将实验测得数据进行多变量分析,在PLS模型中重要性 因子(variable importance to projection,VIP值)反映了这些变量对模型响应的重要 性。乙腈、甲醇、乙醇、氯仿、水乙腈、水、甲醇、氯仿和乙醇的VIP值依次为1.503,0.802, 0. 651,0. 688和0. 987,结果表明乙腈的提取效率最高,故最终选择乙腈作为血浆样本的提 取溶剂。
[0037] 样品的分析方法为:GC-Q/MS 和 UPLC-Q/TOF-MS。
[0038] 方法学考察:
[0039] 精密度:连续6针得到的仪器精密度RSD < 5%,说明实验中仪器状态良好。选取 血浆内典型的两种内源性代谢物亮氨酸和甘氨酸,考察其日内和日间精度。两种代谢物日 内精密度基本在RSD基本在5%~15%范围内,可以看出总体日间精度度的RSD大于日内 精密度;稳定性:实验中选择25°C进样室温度。结果显示,三天中亮氨酸及甘氨酸稳定性良 好。
[0040] 优选的样品制备及分析
[0041] GC-Q/MS
[0042] 样品处理方法:取200yL血浆于1. 5mL离心管中,加入50yLlmg/mL的2-异 丙基苹果酸溶液内标,涡旋20秒混匀,加入400yL甲醇、氯仿和水的混合溶液(比例为 2.5 : 1 : 1),然后在 70°C 的金属浴上振摇 30min(1200rpm),16000gX5min离心(4°C), 取500yL上清于1. 5mL离心管中,加入500yL蒸馏水,祸旋混勾,然后16000gX5min离心 (4°C ),取500 yL上清于1.5mL离心管中,在室温下用氮吹仪吹干,所得残渣用80yL的甲 氧胺吡啶溶液溶解,在50°C条件下肟化8h,加入60yLN-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺 试剂,在70°C条件下衍生化2h,即得。
[0043] GC-Q/MS条件:美国Agilent 7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪。色谱柱HP-5MS 毛细管柱(30.0 mXO. 25mm,毛细管厚度0. 25 ym);载气为高纯氦气,流速1. OmL/min ;进样 量2 y L ;程序升温:80°C恒温2min,80°C -300°C (5°C /min)恒温6min ;不分流,进样温度 300°C ;接口温度300°C ;离子源温度200°C ;电子能量50eV ;溶剂延迟3min ;采用全扫描模 式,扫描质量范围:m/z 30-600道尔顿。
[0044] UPLC-Q/TOF-MS :
[0045] 样品处理方法:取100 y L血浆于1. 5mL离心管中,加入400 y L乙腈,涡旋30秒后 混匀,13000rpmX10min离心(4°C ),取200 yL上清于1.5mL离心管中,在室温下用氮吹仪 吹干,所得残渣用300 y L的20%乙腈水溶液溶解,即得。
[0046] UPLC-Q/TOF-MS 条件:
[0047] 色谱分离采用超高效液相色谱系统(UPLC,Agilent 1290,USA)。色谱柱为Waters BH1 (:18柱(lOOmmX 2. 1mm,1. 7 y m),柱温25°C,进样室温度为室温,进样量2 y L〇
[0048] 正、负离子模式流动相组成均是A为体积浓度0. 1%甲酸水溶液,B为体积浓度 0. 1 %甲酸乙腈溶液。
[0049]梯度洗脱条件:0~lmin为0~30%B相,2min内B相线性增加到60%,3~8min 线性变化至90B相,然后在8~9min线性增加至100%B相并保持lmin;流速0. 3mL/min, 柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测。
[0050] 质谱分析采用四级杆-飞行时间质谱(Agilent 6530Q-T0
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