一种水基胶中异噻唑啉酮杀菌剂测定的液相色谱-串联质谱法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水基胶中杀菌防腐剂理化检验技术领域，具体为一种水基胶中异噻唑 啉酮杀菌剂测定的液相色谱-串联质谱法。
【背景技术】
[0002] [1] 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MI)、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMI) 和1，2-苯并异噻啉-3-酮（BIT)，属于异噻唑啉酮及其衍生物类，是一类新型的高效广谱防 腐杀菌剂，广泛用于化妆品、涂料等行业防腐杀菌。异噻唑啉酮类化合物具有细胞毒性和神 经毒性，对皮肤有致敏反应，会出现眼睛、皮肤接触发生过敏或皮炎等症状，还可导致皮肤 灼伤或哮喘。因此，各国在玩具、食品、化妆品等领域对上述异噻唑啉酮类杀菌剂的用量、残 留量和特定迀移量有严格的限制，如欧盟玩具协调标准EN71-9-2005 (MI、CMI和BIT限量分 别为10、10和5mg/kg，并且MI和BIT总限量为15mg/kg)、我国GB 9685-2008《食品容器、 包装材料用添加剂使用卫生标准》(MI、CMI和BIT的特定迀移限量分别为0. 5mg/kg、不能检 出和1. 2mg/kg)，我国和欧盟化妆品法规对MI和CMI的限量均分别为0. 01 %和0. 0015%。
[0003] [2]水基胶通常用于各种包装纸的粘结部位，如果水基胶中含有异噻唑啉酮并长 期接触，存在因接触包装纸等而间接转移至人体的风险，会对人体健康会造成安全隐患。因 此，建立快速、灵敏、准确的分析方法来分析检测水基胶中的异噻唑啉酮杀菌剂残留量至关 重要。
[0004] [3]近年来，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS)技术快速发展，已经越来越多地被应 用于化妆品、环境等领域样本中MI、CMI和BIT等异噻唑啉酮类防腐剂含量的检测，与气相 色谱-质谱和液相色谱-紫外检测相比，LC-MS/MS更加适合于复杂体系中异噻唑啉酮类化 合物的测定，其抗干扰能力更强，具有更高的灵敏度和选择性，可以大大减少假阳性的检测 结果，对样品前处理的要求更低，而且分析时间短，灵敏度高，因此受到了广泛的关注。
[0005] [4]目前报道的异噻唑啉酮杀菌剂（LC-MS/MS)法主要检测对象有玩具、化妆品、 食品包装纸等，未见有水基胶中异噻唑啉酮杀菌剂LC-MS/MS法的文献报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种利用LC-MS/MS来测定水基胶中异噻唑啉酮杀菌剂的 定性定量测定方法，该方法具有操作简便、分析速度快、灵敏度高、准确性和稳定性好，特别 适用于批量样品分析的水基胶中MI、CMI和BIT的检测。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：称取水基胶，先加入一定体积的水 进行分散，再加入甲醇振荡萃取，离心、稀释后，以Luna 3u PFP(2)色谱柱为分析柱，以甲醇 和水混合液作为流动相，采用LC-MS/MS测定水基胶中MI、CMI和BIT的含量，以同位素内标 法定量。
[0008] 本发明提供的方法包括：称取水基胶，先加入一定体积的水进行分散，再加入甲醇 振荡萃取，离心、稀释后，以Luna 3u PFP(2)色谱柱为分析柱，以甲醇和水混合液作为流动 相，采用LC-MS/MS测定水基胶中MI、CMI和BIT的含量，以同位素内标法定量。
[0009] 优选的方案为：①称取0. 2~0. 3g水基胶，先加入2~5mL的水进行分散，再加入 甲醇振荡萃取，取1~5ml溶液于离心管中，以10000~150000g离心10~20min，稀释和 加入内标后，经0.22 ym有机相滤膜过滤；②在测定水基胶的过程中以Luna 3u PFP (2)色 谱柱为分析柱，以甲醇和水混合液作为流动相，流动相流速0. 4~0. 6mL/min，采用LC-MS/ MS测定水基胶中MI、CMI和BIT的含量，以同位素内标法定量。
[0010] 更优选的方案为：①称取〇. 3g水基胶，先加入5mL的水进行分散，再加入20mL甲 醇振荡萃取，转速150r/min，时间30min，移取约1. 8mL萃取液于2mL离心管中离心10min， 转速为l〇〇〇〇r/min ;准确移取lmL上清液至10mL容量瓶中，加入100 y L浓度为10mg/L 的内标使用液，用甲醇定容，取约2mL过0. 22 ym有机相滤膜；②测定水基胶中MI、CMI和 BIT过程中，色谱柱为菲罗门公司生产的Luna 3u PFP(2)柱，规格为3ym，150mmX4.6mm， 柱温30°C，流动相流速0. 5mL/min，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1 ;③在测定水基胶中 MI、CMI和BIT过程中，采用的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI);扫描方式：正离 子扫描；检测方式：多反应监测（MRM);离子源温度：600°C ;离子对的驻留监测时间（dwell time) :50ms ;辅助气Gasl压力：55Ps i ;辅助气Gas2压力：55Ps i ;各分析物的定量离子 对、定性离子对及去簇电压（DP)、碰撞能量（CE)见表2 ;
[0011] 表1梯度洗脱程序
[0012]
[0013] 表2质谱检测参数表
[0014]
[0015] 注定量离子。
[0016] MI的内标为：d3-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮.盐酸盐（MI-d 3) ;CMI的内标为： d3-5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMI-d3) ;BIT的内标为：13C6-1，2-苯并异噻啉-3-酮 (BIT-13C6)。
[0017] 所述的水基胶为接嘴胶、搭口胶、包装胶、中线胶，质谱采用美国应用生物系统公 司的API4500QTRAP质谱仪，液相色谱采用美国Thermo公司的DI0NEXU3000型高效液相色 谱仪，并配备有真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、恒温柱箱和色谱质谱工作站。
[0018] 本发明最优选的步骤如下：
[0019] 1、提取
[0020] 称取水基胶0. 3g，精确至0. lmg，置于50mL具塞三角瓶中，用5mL水分散后加入 20mL甲醇，150r/min振荡萃取30min，移取约1. 8mL萃取液于2mL离心管中离心10min，转 速为 10000r/min。
[0021] 2、稀释
[0022] 准确移取lmL上清液至10mL容量瓶中，加入100 yL内标使用液，用甲醇定容，取 约2mL过0. 22 y m有机相滤膜，待LC-MS/MS检测。
[0023] 3、内标溶液的制备
[0024] 准确称取1.Omg的MI-d3、CMI-d#P BIT- 13C6,分别置于3只10mL容量瓶中，用甲醇 稀释至刻度，配制成浓度均为l〇〇mg/L的内标储备液。分别移取MI-d3、CMI-djP BIT- 13C6 的储备液5.OmL至50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成MI-d3、CMI-d# BIT- %浓 度为10mg/L的混合内标工作溶液。
[0025] 4、标准溶液的制备
[0026] 分别称取适量的3种异噻唑啉酮标准物质，用甲醇配制成浓度为1000mg/L的标准 储备溶液。分别准确移取lmL的MI、lmL的CMI、0. 25mL的BIT标准储备液于100mL容量瓶 中，用甲醇定容，配制浓度为MI、CMI浓度为10mg/L，BIT浓度为4mg/L的混合标准储备液。
[0027] 分别准确移取 2 y L、10 y L、50 y L、100 y L、250 y L、500 y L、100 y L 混合标准溶液 至lOmL容量瓶中，加入100 yL内标工作溶液，用甲醇定容至刻度。
[0028] 5、测定
[0029] 移取以上配制好的不同浓度的标准工作溶液和试样溶液，注入液相色谱-串联质 谱仪；
[0030] 采用的液相色谱条件为：
[0031]--色谱柱：Luna3uPFP (2)，4. 6x150mm，3. 0ym;
[0032] 一一流动相：甲醇和水，梯度洗脱，梯度见表1 ;
[0033] --流速：0? 5mL/min ；
[0034] --进样量：10 U L ;
[0035] --柱温：30°C ;
[0036] 表1梯度洗脱程序
[0037]
[0038] 采用的质谱条件为：
[0039] --离子源：电喷雾离子源（ESI);
[0040] --扫描方式：正离子扫描；
[0041] --检测方式：多反应监测（MRM);
[0042] --离子源温度：600°C ;
[0043] --离子对的驻留监测时间（dwel 1 t ime) :50ms
[0044] --辅助气Gasl压力：55Psi;
[0045] --辅助气Gas2压力：55Psi;
[0046] 各分析物的定量离子对、定性离子对及去簇电压（DP)、碰撞能量（CE)见表2。
[0047] 表2质谱检测参数表
[0048]
[0049] 注：*定量离子
[0050] 6、结果计算
[0051] 对混合标准工作溶液进行LC-MS/MS分析，得到各定量离子的峰面积，然后计算各 目标化合物与对应内标的峰面积之比（MI与MI-d 3相比、CMI与CMI-d3相比、BIT与BIT-13C6 相比），拟合峰面积比与浓度成线性，且要求线性相关系数R2多0. 99。对试样萃取液进行 分析，依据内标法由混合标准工作曲线计算得到测定值。
[0052] 7、方法验证
[0053] 本发明的方法克服了现有技术的不足，针对水基胶样品优化了样品前处理方法和 仪器检测条件，与现有技术相比具有如下优良效果：
[0054] 本发明选择LC-MS/MS作为检测手段，相对液相紫外检测器，其抗干扰能力更强， 具有更高的灵敏度和选择性，可以大大减少假阳性的检测结果，对样品前处理的要求更低。
[0055] 通过选择目标物的同位素作为内标，显著降低了LC-MS/MS基质效应，提高方法的 回收率，通过稀释，实现水基胶中异噻唑啉酮的准确定量，并同时降低基质效应。本发明方 法首次基于使用液相色谱串联质谱技术分析水基胶中3种异噻唑啉酮类杀菌剂。
[0056] 本发明方法具有灵敏度高、准确可靠及重复性好的优点。
[0057] (1)标准曲线及方法检测限：
[0058] 在优化的仪器条件下，对质量浓度MI和CMI为0. 002~1. Omg/L，BIT为0. 0008~ 0. 40mg/L的标准工作溶液进行测定，以目标物峰面积对标准工作溶液的质量浓度进行线性 回归，得到线性回归方程，呈良好的线性关系，相关系数r多0.999。最低浓度的标准溶液 平行测定10次，所得测定结果标准偏差的3倍即为测定方法的检出限，检出限为0. 014~ 0. 018mg/kg，定量下限为0. 045~0. 059mg/kg，结果表明该方法能达到定量检测的目的（表 3) 〇
[0059] 表3标准曲线及方法检测限
[0060]
[0061] (2)重复性和加标回收率：
[0062] 在水基胶样品中加入一定量的标准物质，然后进行前处理和LC-MS/MS分析，并按 照加标量和测定值计算其回收率，结果见表4。由表4可以看出，3种异噻唑