Lc-ms测试物中不挥发性缓冲盐含量的降低方法
【技术领域】
[0001] 本申请属于分析化学技术领域，涉及一种液相色谱-质谱法中的相关操作，特别 是涉及一种用于降低液相色谱-质谱（LC-MS)法测试物中缓冲盐含量的方法。本申请方法 可以有效地降低高效液相色谱洗脱液中的缓冲盐含量，从而使得该洗脱液在用于后续的质 谱测定时减少对质谱仪的损耗。本发明采用简单的处理方法，可以实现LC-MS法的LC洗脱 馏份中不挥发性缓冲盐浓度的大大降低，并且目标物质不会损耗。
【背景技术】
[0002] 质谱分析是一种测量离子质荷比（质量-电荷比）的分析方法，其基本原理是使 试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用， 形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色 散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。
[0003] 质谱技术是一种鉴定技术，在有机分子的鉴定方面发挥非常重要的作用。它能快 速而极为准确地测定生物大分子的分子量，使蛋白质组研宄从蛋白质鉴定深入到高级结构 研宄以及各种蛋白质之间的相互作用研宄。
[0004] 随着质谱技术的发展，质谱技术的应用领域也越来越广。由于质谱分析具有灵敏 度高，样品用量少，分析速度快，分离和鉴定同时进行等优点，因此，质谱技术广泛的应用于 化学，化工，环境，能源，医药，运动医学，刑事科学技术，生命科学，材料科学等各个领域。
[0005] 质谱仪种类繁多，不同仪器应用特点也不同，一般来说，在300°C左右能汽化的样 品，可以优先考虑用气相色谱-质谱（GC-MS)进行分析，因为GC-MS使用EI源，得到的质谱 信息多，可以进行库检索。毛细管柱的分离效果也好。如果在300°C左右不能汽化，则需要 用LC-MS分析，此时主要得分子量信息，如果是串联质谱，还可以得一些结构信息。如果是 生物大分子，主要利用LC-MS和MALDI-TOF分析，主要得分子量信息。对于蛋白质样品，还 可以测定氨基酸序列。质谱仪的分辨率是一项重要技术指标，高分辨质谱仪可以提供化合 物组成式，这对于结构测定是非常重要的。双聚焦质谱仪，傅立叶变换质谱仪，带反射器的 飞行时间质谱仪等都具有高分辨功能。
[0006] 质谱分析法对样品有一定的要求。进行GC-MS分析的样品应是有机溶液，水溶液 中的有机物一般不能测定，须进行萃取分离变为有机溶液，或采用顶空进样技术。有些化合 物极性太强，在加热过程中易分解，例如有机酸类化合物，此时可以进行酯化处理，将酸变 为酯再进行GC-MS分析，由分析结果可以推测酸的结构。如果样品不能汽化也不能酯化，那 就只能进行LC-MS分析了。对于极性样品，一般采用ESI源，对于非极性样品，采用APCI源。
[0007] 液相色谱-质谱联用仪（liquid Chromatograph Mass Spectrometer)，简称 LC-MS，是液相色谱与质谱联用的仪器。它结合了液相色谱仪有效分离热不稳性及高沸点化 合物的分离能力与质谱仪很强的组分鉴定能力。是一种分离分析复杂有机混合物的有效手 段。
[0008] 色谱-质谱联用技术是当代最重要的分离和鉴定的分析方法之一。色谱的优势在 于分离，色谱的分离能力为混合物分离提供了最有效的选择，但色谱方法难以得到结构信 息，其主要靠与标样对比达到对未知物结构的推定；在对复杂混合未知物的结构分析方面 显得薄弱；在常规的紫外检测器上对于无紫外吸收化合物的检测和大量未知化合物的定性 分析还需依赖于其他手段。质谱法能提供丰富的结构信息，用样量又是几种谱学方法中用 量最少的，但其样品需经预处理（纯化、分离），程序复杂、耗时长。长期以来，人们为解决这 两种技术的弱点发展了许多技术，其中色谱-质谱联用技术是最具发展和应用前景的技术 之一。目前应用较多的是气相色谱-质谱（GC-MS)联用。但是GC要求样品具有一定的蒸 气压，只有20%的药品可不经过预先的化学处理而能满意地用气相色谱分离，多种情况下 所研宄的药物需要经过适当的预处理和衍生化，以使之成为易汽化的样品才能进行GC-MS 分析。而HPLC可分离极性的、离子化的、不易挥发的高分子质量和热不稳定的化合物，同 时LC-MS联机弥补了传统LC检测器的不足，具有高分离能力，高灵敏度，应用范围更广和具 有极强的专属性等特点，越来越受到人们的重视。据估计已知化合物中约80%的化合物均 为亲水性强、挥发性低的有机物，热不稳定化合物及生物大分子，这些化合物广泛存在于当 前应用和发展最广泛、最有潜力的领域，包括生物、医药、化工和环境等方面，它们需要用LC 分离。因此，LC与MS的联用可以解决GC-MS无法解决的问题。
[0009] 液相色谱-质谱联用仪是液相色谱与质谱联用的仪器。它结合了液相色谱仪有效 分离热不稳性及高沸点化合物的分离能力与质谱仪很强的组分鉴定能力。是一种分离分析 复杂有机混合物的有效手段。联机的关键是适用接口的开发，必须在试样组分进入离子源 前去除溶剂，目前，多采用履带式加热传送带。
[0010] 液相色谱质谱联用仪（liquid Chromatograph Mass Spectrometer)，简称 LC-MS， 是有机物分析市场中的高端仪器。液相色谱（LC)能够有效的将有机物待测样品中的有机 物成分分离开，而质谱（MS)能够对分开的有机物逐个的分析，得到有机物分子量，结构（在 某些情况下）和浓度（定量分析）的信息。强大的电喷雾电离技术造就了 LC-MS质谱图十 分简洁，后期数据处理简单的特点。LC-MS是有机物分析实验室，药物、食品检验室，生产过 程控制、质检等部门必不可少的分析工具。
[0011] 液相色谱质谱联用仪特点：液相色谱和质谱连接，可以增加额外的分析能力，能够 准确鉴定和定量像细胞和组织裂解液，血液，血浆，尿液和口腔液等复杂样品基质中的微量 化合物。高效液相色谱质谱系统（ABSciex Eksigent LC/MS和LC/MS/MS)提供了一些独 特的优势，包括：（1)快速分析和流转所需的最少样品准备；(2)高灵敏度并结合可分析多 个化合物能力，甚至可以跨越化合物的种类；（3)高精确度，高分辨率鉴定和量化目标分析 物。
[0012] 尽管人们通过液相色谱-质谱联用解决了诸多分析化学领域的难题，然而，进行 LC-MS分析时，其样品通常要求是水溶液或甲醇溶液，并且特别地要求液相色谱的流动相中 不应含有或者尽可能少地含有不挥发的盐。
[0013] 但是，令人遗憾的是，作为液相色谱例如高效液相色谱的流动相，通常需要向其中 添加一些不具挥发的缓冲盐以获得优异的色谱分离效果，但是这些包含不具挥发的缓冲盐 的色谱洗脱馏份在用于接下来的质谱测定时，这些不挥发性缓冲盐是难以除去或者难以与 色谱洗脱馏份中的目标物分离开的。例如，中国药典2010年版二部第6页收载的乙酰谷 酰胺在测定其中的杂质即有关物质时，通过液相色谱法进行分离分析，该液相色谱使用的 流动相中包含磷酸二氢钾，在此情况下如果要确定其中杂质峰的归属或者化学结构的情况 下，使杂质峰色谱馏份导入质谱仪来检测是有益的，但是杂质峰色谱馏份中所包含的磷酸 二氢钾不具挥发性，不利于质谱测定。如果采用当前常的方法对该杂质峰色谱馏份进行浓 缩论（通常采用氮气吹干的方法），尽管目标物即杂质浓缩了，但是其中的磷酸盐也同样地 会成比例地浓缩，并且可能会引起pH的改变，影响待测成分的稳定性，因此这种浓缩方法 不是降低MS待测物中不挥发性缓冲盐浓度的适宜方法。因此这种浓缩方法无法实现降低 MS待测物中不挥发性缓冲盐浓度的目的。
[0014] 因此，化学分析领域技术人员迫切期待有一种能够有效地降低液相色谱-质谱法 测试物中不挥发性缓冲盐含量甚至除去的方法。
【发明内容】
[0015] 本申请的目的在于提供一种能够有效地降低液相色谱-质谱法测试物中不挥发 性缓冲盐含量甚至除去的方法。已经出人意料地发现，使液相色谱洗脱馏份照本申请方法 进行处理后，可以显著地降低该液相色谱洗脱馏份中不挥发性缓冲盐的含量。本申请基于 该发现而得以完成。
[0016] 为此，本发明第一方法提供了一种用于液相色谱-质谱分析测试中降低液相色谱 洗脱馏份中不挥发性缓冲盐含量的方法，该方法包括如下步骤：
[0017] (1)使检测物配制成溶液，将该溶液注入液相色谱仪以进行洗脱，从液相色谱洗脱 液收集待用于质谱检测的目标物洗脱馏份；
[0018] (2)使所述洗脱馏份与助剂充分混合（任选的可额外加入有机溶剂（例如甲醇和 /或乙腈）混合）；
[0019] (3)使所得混合液通过离心或者过滤的方式使悬浮物和清液分离，分取清液；和， 任选的
[0020] (4)将所得清液进行浓缩，即得。
[0021] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述液相色谱是反相高效液相色 谱。
[0022] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述液相色谱洗脱所用的流动相 是水相和有机相的混合液。在一个实施方案中，所述有机相例如但不限于：甲醇、乙腈、乙 醇、四氢呋喃、异丙醇及其组合；特别是甲醇和乙腈。在一个实施方案中，所述水相中包含不 挥发性缓冲盐。
[0023] 根据本发明根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述水相和有机相的 体积比可以是5 :95~95 :5的范围。
[0024] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述不挥发性缓冲盐例如但不限 于磷酸盐、枸橼酸盐、醋酸盐、高氯酸盐中的一种或多种。
[0025] 根据本发明