一种高通量联合检测丙肝病毒抗原抗体的试剂的制作方法
【技术领域】 [0001] 本发明属于丙型肝炎检测技术领域，具体涉及一种高通量联合检测丙肝病毒抗原-抗 体的试剂。
【背景技术】 [0002] 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus,HCV)感染而引起的一种全球性传 染病。据估计目前全世界有1. 7亿丙肝病毒感染者，我国的丙肝感染率大约为30%，目前至 少有4000~6000万丙肝患者。其中有80~85%的感染者将发展为慢性丙型肝炎，其中又有 20%可发展为肝纤维化，最终有4~5%的肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌，危害十分严重。
[0003] 目前，尚无针对丙型肝炎病毒的特效治疗药物，丙型肝炎疫苗的研制也因HCV快 速变异而困难重重，短期内难有突破进展。因此，HCV的早期诊断对于筛查HCV传染源、指 导临床治疗和预后判断有重大意义。
[0004] 现有HCV在临床上的检测方式主要有PCR检测、丙型肝炎病毒抗体检测和丙型肝 炎病毒核心抗原检测试剂盒，三种检测方法中，PCR检测方法灵敏度高且结果准确，但是方 法操作繁琐，需要的人员技术能力强，不容易在各个医院进行推广；丙型肝炎病毒抗体检测 试剂是临床上最常见的一种丙肝检测方法，但是该检测存在一个"窗口期"，即在丙肝的感 染初期，病人体内还没有出现免疫性抗体，无法在早期就获得检测结果，造成漏诊的状况； 丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂在最近几年开始逐渐被医院所接受，市场占有量也不断增 大，但是针对于丙肝病人的后期跟踪检测，没有很好的跟踪效果。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述各种检测方法存在的问题，本发明提供一种高通量联合检测丙型肝炎病 毒抗体及抗原的试剂。该试剂利用流式细胞术的原理，在不同浓度FITC荧光素标记的微球 对应包被抗体和抗原，在加入检测样本后，与PE标记的配对抗体和抗原组成三明治夹心结 构，在480nm激发光作用下，不同浓度荧光素发射光强度不同，能够高通量达到同时检测丙 肝抗原和抗体的效果。采用荧光检测的原理，提高了检测的灵敏度，可以同时定性检测抗原 和抗体，能够确定检测样本中是否具有丙型肝炎病毒的感染，具有很高的临床应用价值。
[0006] 本发明是通过以下措施实现的： 一种化学发光法联合检测丙型肝炎病毒抗体-抗原试剂，其组分如下： 组分1 (Rl)FITC荧光微球试剂： 包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球 0. 1%-1% ; 包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球 0. 1%-1% ; Tris 12.lg/L； BSA 0.5g/L； PC-300 0. 1% ； 用去离子水配制，HC1调整pH为7. 6。
[0007] 其中FITC高亮微球制备流程为：将异硫氰酸荧光素（FITC)溶解到二甲基亚砜中 配制lmg/mL的浓染液，与表面被同时氨基化和羧基化的聚苯乙稀微球按照1 :1的比例混 匀，避光保存2h后，利用无水乙醇洗涤，15000r/min离心5min，去除液体，将离心的固体分 散到100mL的HEPES缓冲液（0. 1M，pH=7. 4)中，2-8°C放置，保存。
[0008] FITC低亮微球制备流程为：将异硫氰酸荧光素（FITC)溶解到二甲基亚砜中配制 lmg/mL的浓染液，与表面被同时氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球按照1 :3的比例混匀，避 光保存2h后，利用无水乙醇洗涤，5000r/min离心5min，去除液体，将离心的固体分散到 100mL的HEPES缓冲液（0? 1M，pH=7. 4)中，2-8°C放置，保存。
[0009] 包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球制备流程：取上述FITC高亮微球lmL， 加入lmL含0.005gN-羟基丁二酰亚胺和0.005g碳化二亚胺的碳酸盐缓冲液（0. 1M， pH=8. 0)，室温，避光，放置2h后，5000r/min离心5min，加入100yL丙肝核心抗原包被抗 体，加入lmL磷酸盐缓冲液（0. 2M，pH=7. 4)，室温震荡孵育4h，加入含01%BSA和0. 5%吐温 20的溶液lmL，4°C震荡孵育12h，用lmL磷酸盐缓冲液（0. 2M，pH=7. 4)洗涤离心三次，加入 OOmL的HEPES缓冲液（0. 1M，pH=7. 4)中，2-8°C放置，保存。
[0010] 包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球制备流程：取上述FITC低亮微球lmL，加 入lmL含0.005gN-羟基丁二酰亚胺和0.005g碳化二亚胺的碳酸盐缓冲液（0. 1M， pH=8. 0)，室温，避光，放置2h后，5000r/min离心5min，加入100yL丙肝病毒混合蛋白 (NS3、NS4和NS5)，各种类浓度比例为1 :1 :1，加入lmL磷酸盐缓冲液（0. 2M，pH=7. 4)，室温 震荡孵育4h，加入含01%BSA和0. 5%吐温20的溶液lmL，4°C震荡孵育12h，用lmL磷酸盐缓 冲液（0? 2M，pH=7. 4)洗涤离心三次，加入100mL的HEPES缓冲液（0? 1M，pH=7. 4)中，2-8°C 放置，保存。
[0011] 组分2 (R2 )PE标记试剂： PE标记的HCV-cAg抗体 0? 1%-1% ; PE标记的NS3蛋白 0. 1%-1 ; PE标记的NS4蛋白 0? 1%-1% ; PE标记的NS5蛋白 0? 1%-1% ; Tris 12.lg/L； BSA 0.5g/L； PC-300 0. 1% ； 用去离子水配制，HC1调整pH为7. 6。
[0012] 其中PE标记抗体或蛋白制备流程为：（1)疏基化藻红蛋白（phycoerthrinPE)的 制备：取 600yL的 15. 5mg/mL盐酸疏醇亚胺（iminothiolanehydrochloride)加到 1. 2mL 的3. 6mg/mL的PE(藻红蛋白）中，和1. 2mL磷酸盐缓冲液（0? 2M，pH6. 8)混合，装入透析 袋置入50mmol/LpH6. 8磷酸盐缓冲液中透析，4°C过夜，再换用50mmol/LpH7. 5磷酸盐缓 冲液透析6h。（2)PE标记抗体或蛋白：取30yL含3-(2_吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀 酰亚胺（STOP) 1.lmg/mL的乙醇溶液，加入700yL含4. 2mg/mL抗体或蛋白的磷酸盐缓冲 液（50mmol/L，pH7. 5)，在室温中反应2. 5h。再加入上述巯基化藻红蛋白400yL，室温反应 12h，加入100y1的50mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，用50mmol/LpH7. 5磷酸盐缓冲液 4°C透析透析过夜，加入0. 0l%Na3N3分装，2-8 °C放置，保存。
[0013] 清洗液 磷酸氢二钠 1. 974g/L 磷酸二氢钾 0? 224g/L 氯化钠 〇. 9g/L 吐温-20 0.5%; 所有组分都用去离子水进行溶解，配制成溶液状态。
[0014] 阳性对照 丙型肝炎病毒核心抗原 1% 丙型肝炎病毒抗体(抗NS3) 1% 丙型肝炎病毒抗体(抗NS4) 1% 丙型肝炎病毒抗体(抗NS5 ) 1% 用小牛血清溶解。
[0015] 阴性对照 BSA 4% 用小牛血清溶解。
[0016] 本发明的试剂盒的使用方法如下： (1) 根据实验需要准备平底试管，做好编号； (2) 在试管中加入15y1阳性对照、阴性对照或样本； (3) 用连续移液器在试管中加入30y1R2 (PE标记试剂）； (4) 置于振荡器上轻轻震荡至彻底混匀后，37°C温育5分钟； (5) 用连续移液器在试管中加入30ylR1 (FITC荧光微球试剂)，加样时要保证荧光微 球试剂充分混匀； (6) 置于振荡器上轻轻振荡至彻底混匀后，37°C温育5分钟； (7) 将试管利用离心机5000r/min离心5min，静置2分钟，然后弧线倾倒上清液； (8) 用连续移液器在试管中加入300y1清洗液，置于振荡器上1500~2000rpm震荡20 秒，至彻底混匀，重复第（7 )操作1次； (9) 重复第（8)操作2次； (10) 每个试管加入1000y1清洗液，用流式细胞仪检测发光强度FL2-H。
[0017] 临界值确定：阴性对照平均FL2-H值X2. 1 (若阴性对照平均FL2-H值彡5时，按 5计算；0D>5时，按实际测定阴性对照平均FL2-H值X2. 1计算)。测试标本的FL2-H值小 于临界值则为HCV阴性。测试标本中的FL2-H值等于或大于临界值则为HCV阳性。
[0018] 本发明试剂盒的反应原理图，如图1所示。
[0019] 通过本发明的技术方案，可以获得一种同时检测丙型肝炎病毒抗原-抗的体联合 检测试剂盒，该试剂盒通过在不同浓度FITC荧光素标记的微球对应包被抗体和抗原，在加 入检测样本后，与PE标记的配对抗体和抗原组成三明治夹心结构，在480nm激发光作用下， 不同浓度荧光素发射光强度不同，能够高通量达到同时检测丙肝抗原和抗体的效果。利 用荧光显色效果，增强了反应的灵敏度，同时利用FITC标记微球同时检测抗原和抗体的方 式，可以同时对丙型肝炎病毒抗体和核心抗原进行检测。该高通量检测试剂盒，可以在流式 细胞仪上实现对丙肝核心抗原和丙肝抗体的同时监控，更直观识别丙肝的感染时期，对临 床丙肝检测具有很高的应用价值。
[0020] 本发明试剂盒检测阳性的结果图，如图2所示。
[0021] 本发明的丙型肝炎病毒抗原_抗体联合检测的试剂盒的创新之处在于： (1)利用高浓度FITC标记的微球包被抗丙肝核心抗原抗体，同时利用低浓度FITC标记 的微球包被丙肝其它片段抗原（NS3、NS4、NS5)，通过免疫反应可以将样本中的丙肝核心抗 原及多种片段抗原的抗体都可以通过免疫反应吸附到微球表面，避免了漏检。
[0022] (2)试剂盒中的PE标记物，是对包被抗体和抗原配对的对应抗体和抗原进行PE酶 标记，能够与包被抗体和抗原配对应用，保证了试剂盒检测的特异性，准确检测丙肝病毒。
[0023] (3)本发明的试剂盒，选用流式细胞术的原理，利用荧光显色技术计算结果，有效 地保证了试剂盒的灵敏度，即使在微量状态下也可以检测，达到早发现的效果。
[0024] (4)本发明试剂盒组分为液体组分，摆脱了酶联免疫吸附法采用固相载体的影响， 不受检测样本的约束，检测结果更直观。有研究采用酶联免疫吸附法对丙肝核心抗原-丙 肝抗体进行联合检测，由于样本数量原因会造成板条浪费，而且无法直观表现出丙肝核心 抗原或抗体的含量，本发明试剂盒采用不同FITC含量标记的微球来区分不同检测项目，可 以达到同时分别检测丙肝核心抗原和丙肝抗体的目的，对丙肝的检测和治疗跟踪都具有很 好的临床应用价值。
【附图说明】
[0025] 图1为反应原理示意图； 图2为检测阳性结果图； 图3为实施例1不同感染天数样本结果图，其中，a、感染1-6天的检测结果(核心抗原 与抗体均为阴性)山、感染7-38天的检测结果(核心抗原阳性、抗体阴性）;c、感染39天后的 检测结果(核心抗原与抗体均为阳性)。
【具体实施方式】
[0026] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
[0027] 实施例1 检测试剂的组分及浓度为 组分1 (Rl)FITC荧光微球试剂： 包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球 0. 1% 包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球 0.1% Tris 12.lg/L BSA 0.5g/L PC-300 0.1% 用去离子水配制，HC1调整pH为7. 6。
[0028] 组分2 (R2)PE标记试剂： PE标记的HCV-cAg抗体 0. 1% PE标记的NS3蛋白 0.1% PE标记的NS4蛋白 0.1% PE标记的NS5蛋白 0.1% Tris 12.lg/L BSA 0.5g/L PC-300 0.1% 用去离子水配制，HC1调整pH为7. 6。