用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后方法和组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是国际申请号为PCT/US2010/049234,申请人为"阿斯图特医药公司"，发明 名称为"用于肾损伤和肾衰竭的诊断及预后方法和组合物"的PCT申请进入中国国家阶段 后申请号为201080043037. 2的中国国家阶段申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明要求2009年9月18日提交的美国临时专利申请61/243, 995、2009年9月 18日提交的61/244, 000、以及2009年10月23日提交的61/254, 636的优先权，上述每个 申请据此全文并入，包括所有表格、附图及权利要求。
【背景技术】
[0003] 本发明的技术背景的以下论述仅用于帮助读者理解本发明且并非认同描述或构 成本发明的现有技术。
[0004] 肾脏负责从体内排泄水和溶解物。它的功能包括维持酸碱平衡、调节电解质浓 度、控制血容量和调节血压。因此，肾脏功能因损伤和/或疾病的丧失导致大量的发病及 死亡率。肾损伤的详细论述提供在Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine,第 17版，McGrawHill，NewYork，第1741-1830页中，该文献全文以引用的方式并入。肾病 和/或肾损伤可为急性的或慢性的。急性和慢性肾病描述如下（来自CurrentMedical Diagnosis&Treatment2008，第 47 版，McGrawHill，NewYork,第 785-815 页，该文献全 文以引用的方式并入）急性肾衰竭是肾功能在几小时至几天内恶化，导致含氮废物（如 尿素氮）和肌酐滞留在血液中。这些物质的滞留被称为氮质血症。慢性肾衰竭（慢性肾 病）因肾功能在几个月至几年内的异常丧失引起。
[0005] 急性肾衰竭（ARF，也称为急性肾损伤，或AKI)是肾小球过滤急剧（一般在约48小 时至1周内检测出）降低。该过滤能力的丧失导致由肾脏正常排泄的含氮（尿素和肌酐） 和不含氮废物的滞留、尿量减少，或两者兼而有之。据报道，ARF的恶化导致约5%需入院 治疗，4-15%需进行心肺旁路手术，多达30%需进行重症监护治疗。ARF按起因可分为肾前 性、肾性或肾后性ARF。肾性疾病可进一步分为肾小球、肾小管、间质和血管异常。ARF的主 要原因描述于下表，该表改自MerckManual,第17版，第222章，其全文以引用的方式并 入。
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[0009] 在缺血性ARF的情况下，病程可分成四个阶段。在持续几小时至几天的起始阶段 期间，肾脏灌注降低正发展为损伤。肾小球超滤减少，滤液流量因肾小管内的碎片而减少， 并且滤液通过受损的上皮发生回漏。此阶段期间，肾损伤可通过肾脏再灌注而得到介导。起 始阶段之后是扩展阶段，该阶段的特征是持续的缺血性损伤和炎症，并且可能涉及内皮损 伤和血管充血。在持续1至2周的维持阶段期间，肾细胞出现损伤，并且肾小球过滤和尿排 出量达到最小。随后可以是恢复阶段，其中肾上皮细胞得以被修复，GFR逐渐复原。尽管如 此，但患有ARF的受试者的存活率可能还是低至约60%。
[0010] 因放射性造影剂（也称为造影介质）及其它肾脏毒素（如环孢霉素）、抗生素（包 括氨基糖苷类）和抗癌药（如顺铂）引起的急性肾损伤在几天至大概一周的时间段内显现 出来。造影诱发的肾病（CIN，其是由放射性造影剂引起的AKI)被认为是由肾内血管收缩 (导致缺血性损伤）且因产生对肾小管上皮细胞具有直接毒性的活性氧物种而引起的。CIN 传统上表现为血尿素氮和血清肌酐的急性（24-48h内发作）但可逆（峰值3-5天，1周内消 除）的升尚。
[0011] 通常报导的用于确定和检测AKI的标准是血清肌酐的急剧（一般在约2-7天内或 在住院期间内）升高。虽然使用血清肌酐的升高来确定和检测AKI已得到良好的确定，但 血清肌酐升高的幅度和确定AKI的测量时间在出版物之间却有很大的差异。传统上，相对 大的血清肌酐增长（如100%、200%、至少100%的增长到2mg/dL以上的值及其它定义） 用于确定AKI。然而，目前的趋势是使用较小的血清肌酐升高来确定AKI。血清肌酐升高、 AKI与相关的健康危险之间的关系的综述见于Praught和Shlipak,CurrOpinNephrol 办口6忖6118 14:265-270,2005和〇16竹〇￥等，了厶1115〇。~印1^〇1 16:3365-3370,2005 中，上 述文献与其中所列的参考文献全文以引用的方式并入。如这些出版物中所述，现在已知急 性恶化的肾功能（AKI)和增加的死亡危险及其它不利的结果与血清肌酐的极小增长有关。 这些增长可确定为相对（百分比）值或标称值（nominalvalue)。已报道，血清肌酐较损 伤前的数值相对增长低至20%就表明了急性恶化的肾功能（AKI)和增大的健康危险，但更 常见报道的确定AKI和增大的健康危险的值是至少25%的相对增长。已报道，低至0. 3mg/ 也、0.21^/也或甚至0.11^/也的标称增长表明有恶化的肾功能和增大的死亡危险。已经用 血清肌酐升至这些阈值的不同时间段来确定AKI，例如2天、3天、7天或定义为患者住院或 入住重症监护病房时间的变化时间段。这些研究表明，对于恶化的肾功能或AKI，没有特定 的血清肌酐升高阈值（或升高所用的时间段），而是危险性随血清肌酐升高幅度的增加而 连续增大。
[0012] 一项研究（Lassnigg等，JAmSocNephrol15:1597-1605, 2004，其全文以引用 的方式并入）对血清肌酐的增加和减少进行了研究。心脏手术后具有-o. 1至-o. 3mg/dL 的血清肌酐轻微下降的患者死亡率最低。血清肌酐下降较大（超过或等于-〇.4mg/dL)或 血清肌酐有任何增长的患者死亡率较高。这些研究结果使作者得出结论，即使肾功能的非 常微小的变化（如手术48小时内通过小的肌酐变化所检测到的）也严重影响患者的结果。 为了对用于在临床试验和临床实践中利用血清肌酐来确定AKI的统一分类系统达成共识， 8611〇!11〇等（0^〇&代.8(4) :1?204-12,2004，全文以引用的方式并入）提出了用于将八1(1 患者分级的以下分类：
[0013] "危险":血清肌酐较基线增长1. 5倍，或6小时尿量< 0. 5ml/kg体重/hr;
[0014] "损伤":血清肌酐较基线增长2. 0倍，或12小时尿量〈0. 5ml/kg/hr;
[0015]"衰竭":血清肌酐较基线增长3. 0倍，或肌酐>355ymol/1 (升高>44)，或24小时 排尿量低于〇. 3ml/kg/hr，或至少12小时无尿；
[0016] 并包括两个临床结果：
[0017]"丧失":对肾替代疗法的持续需求超过四周。
[0018]"ESRD"：晚期肾病一对透析的需求超过3个月。
[0019] 将这些标准称作RIFLE标准，这些标准提供了适用于对肾状态进行分类 的临床工具。如Kellum,Crit.CareMed. 36:S141-45, 2008 和Ricci等，Kidney Int. 73, 538-546, 2008中所述（上述每个文献全文以引用的方式并入），RIFLE标准提供了 已在许多研究中得到确认的AKI的统一定义。
[0020] 最近，Mehta等，Crit.Care11:R31(doi: 10. 1186.cc5713), 2007 (此文献全文以 引用的方式并入）提出了用于将AKI患者分级的以下类似分类，其修改自RIFLE:
[0021]"阶段I":血清肌酐增长超过或等于0? 3mg/dL(多26. 4ymol/L)，或增至超过或等 于基线的150% (1. 5倍），或超过6小时的排尿量少于0. 5mL/kg每小时；
[0022] "阶段II" ：血清肌酐增至超过基线的200% (>2倍），或超过12小时的排尿量少 于0. 5mL/kg每小时；
[0023]"阶段III":血清肌酐增至超过基线的300% (>3倍），或血清肌酐彡354ymol/L， 伴有至少44ymol/L的急性增长，或24小时的排尿量少于0. 3mL/kg每小时，或12小时无 尿。
[0024]CIN协调工作组（McCollough等，RevCardiovascMed. 2006 ;7 (4) : 177-197,该文 献全文以引用的方式并入）用25 %的血清肌酐升高来确定造影剂诱发的肾病（一种类型的 AKI)。虽然各组提出的用血清肌酐检测AKI的标准略有不同，但达成共识的是，血清肌酐的 小的变化（如〇. 3mg/dL或25 % )足以检测AKI(恶化的肾功能），并且血清肌酐变化幅度 是AKI严重程度和死亡危险性的指标。
[0025] 虽然在若干天内连续测量血清肌酐被接受为检测和诊断AKI的方法，并且被认为 是用于评价AKI患者的最重要的工具之一，但一般认为血清肌酐在诊断、评估和监测AKI患 者时有一些局限性。根据所用定义的情况，血清肌酐升至被视为AKI诊断值（例如，0.3mg/ dL或25%的升高）的时间段可为48小时或更长。由于AKI中的细胞损伤可在数小时内发 生，则在48小时或更长时间点所检测到的血清肌酐升高可能是损伤的晚期指标，因此依赖 血清肌酐可能延误AKI的诊断。此外，当肾功能快速变化时，血清肌酐并非是准确的肾脏状 态及AKI最严重阶段期间的治疗需求的良好指标。一些AKI患者会完全恢复，一些将需要 透析（短期或长期），而一些则会有其它不利的结果，包括死亡、严重的不良心脏事件和慢 性肾病。因为血清肌酐是过滤速度的指标，所以它并不区分AKI的起因（肾前性、肾性、肾 后性梗阻、粥样栓塞性等）或肾性疾病中损伤的类别或位置（例如，起源于肾小管、肾小球 或间质）。排尿量受到类似的限制，了解这些对管理和治疗AKI患者而言是至关重要的。
[0026] 这些限制强调了需要更好的方法来检测和评估AKI，特别是在早期和亚临床阶段， 但在后期可能出现肾脏的痊愈和恢复阶段也包括在内。此外，需要更好地识别危险的AKI 患者。
【发明内容】
[0027] 本发明的目的是提供评价受试者的肾功能的方法和组合物。如本文中所述，对选 自以下的一种或多种生物标记物的测量可用于对罹患肾功能损伤、肾功能衰弱和/或急性 肾衰竭（也称急性肾损伤）或有罹患上述疾病危险的受试者进行诊断、预后、危险分级、分 期、监测以及确定进一步诊断和治疗方案：免疫球蛋白A、金属蛋白酶抑制剂4、以及血栓调 节蛋白（本文中将每种称为"肾损伤标记物"）。
[0028] 本发明的该等肾损伤标记物可单独使用，或以包含多种肾损伤标记物的组合形式 使用，用于危险分级（即，识别日后有罹患肾功能损伤危险、日后发展为肾功能衰弱、日后 发展为ARF、日后肾功能改善等的受试者）；用于诊断现有的疾病（即，识别罹患肾功能损 伤、已发展为肾功能衰弱、已发展为ARF等的受试者）；用于监测肾功能的恶化或改善；以及 用于预测日后的医疗结果，如肾功能的改善或恶化、死亡危险的降低或提高、受试者需进行 肾替代疗法（即，血液透析、腹膜透析、血液过滤和/或肾移植）的危险性的降低或提高、受 试者肾功能损伤痊愈的危险性的降低或提高、受试者ARF痊愈的危险性的降低或提高、受 试者发展为晚期肾病的危险性的降低或提高、受试者发展为慢性肾衰竭的危险性的降低或 提高、受试者移植肾发生排斥反应的危险性的降低或提高等。
[0029] 在第一方面，本发明涉及评价受试者肾状态的方法。这些方法包括执行一种测定 法，该测定法被设定为检测取自受试者的体液样本中选自免疫球蛋白A、金属蛋白酶抑制剂 4、以及血栓调节蛋白的一种或多种生物标记物。然后将测定结果与受试者的肾状态相关 联，所述测定结果例如为选自以下的一种或多种生物标记物的测定浓度：免疫球蛋白A、金 属蛋白酶抑制剂4、以及血栓调节蛋白。这种与肾状态相关联可包括将测定结果与本文中所 述的受试者的危险分级、诊断、预后、分期、分类和监测中的一种或多种相关联。因此，本发 明利用一种或多种本发明的肾损伤标记物来评价肾损伤。
[0030] 在某些实施方案中，评价本文中所述肾状态的方法是对受试者进行危险分级的方 法；即，确定受试者肾状态的一种或多种日后变化的可能性。在这些实施方案中，将测定结 果与一种或多种上述的日后变化相关联。以下是优选的危险分级实施方案。
[0031] 在优选的危险分级实施方案中，这些方法包括确定受试者日后出现肾功能损伤的 危险，并且将测定结果与出现这种日后肾功能损伤的可能性相关联。例如，可以将每个测定 浓度与阈值相比较。对于"阳向"肾损伤标记物，相对于当测定浓度低于阈值时确定的日后 罹患肾功能损伤的可能性来说，当测定浓度高于阈值时，确定受试者日后罹患肾功能损伤 的可能性增大。对于"阴向"肾损伤标记物，相对于当测定浓度高于阈值时确定的日后罹患 肾功能损伤的可能性来说，当测定浓度低于阈值时，确定受试者日后罹患肾功能损伤的可 能性增大。
[0032] 在其它优选的危险分级实施方案中，这些方法包括确定受试者日后肾功能衰弱的 危险，并且将测定结果与这种肾功能衰弱的可能性相关联。例如，可以将每个测定浓度与阈 值相比较。对于"阳向"肾损伤标记物，相对于当测定浓度低于阈值时确定的日后罹患肾功 能衰弱的可能性来说，当测定浓度高于阈值时，确定受试者日后罹患肾功能衰弱的可能性 增大。对于"阴向"肾损伤标记物，相对于当测定浓度高于阈值时确定的日后罹患肾功能衰 弱的可能性来说，当测定浓度低于阈值时，确定受试者日后罹患肾功能衰弱的可能性增大。
[0033] 又在其它优选的危险分级实施方案中，这些方法包括确定受试者日后肾功能改善 的可能性，并且将测定结果与这种日后肾功能改善的可能性相关联。例如，可以将每个测定 浓度与阈值相比较。对于"阳向"肾损伤标记物，相对于当测定浓度高于阈值时确定的日后 肾功能改善的可能性来说，当测定浓度低于阈值时，确定受试者日后肾功能改善的可能性 增大。对于"阴向"肾损伤标记物，相对于当测定浓度低于阈值时确定的日后肾功能改善的 可能性来说，当测定浓度高于阈值时，确定受试者日后肾功能改善的可能性增大。
[0034] 还在其它优选的危险分级实施方案中，这些方法包括确定受试者发展成ARF的危 险性，并且将结果与这种发展成ARF的可能性相关联。例如，可以将每个测定浓度与阈值相 比较。对于"阳向"肾损伤标记，相对于当测定浓度低于阈值时确定的可能性来说，当测定 浓度高于阈值时，确定受试者发展成ARF的可能性增大。对于"阴向"肾损伤标记，相对于 当测定浓度高于阈值时确定的可能性来说，当测定浓度低于阈值时，确定受试者发展成ARF 的可能性增大。
[0035] 在其它优选的危险分级实施方案中，这些方法包括确定受试者结果的危险性，并 且将测定结果与出现同受试者罹患的肾损伤相关的临床结果的可能性相关联。例如，可以 将每个测定浓度与阈值相比较。对于"阳向"肾损伤标记，当测定浓度高于阈值时，确定受试 者出现以下一种或多种情况的可能性增大：急性肾损伤、发展成AKI的恶化阶段、死亡、需 进行肾替代疗法、需移除肾脏毒素、晚期肾病、心力衰竭、中风、心肌梗塞、发展成慢性肾病 等，这是相对于当测定浓度低于阈值时确定的可能性来说的。对于"阴向"肾损伤标记，当测 定浓度低于阈值时，确定受试者出现以下一种或多种情况的可能性增大：急性肾损伤、发展 成AKI的恶化阶段、死亡、需进行肾替代疗法、需移除肾脏毒素、晚期肾病、心力衰竭、中风、 心肌梗塞、发展成慢性肾病等，这是相对于当测定浓度高于阈值时确定的可能性来说的。
[0036] 在上述危险分级实施方案中，优选地，确定的可能性或危险性是指在从获取受试 者体液样本之时起差不多180天内可能发生所关注的事件。在特别优选的实施方案中，确 定的可能性或危险性涉及在较短的时间段内发生的所关注的事件，所述较短的时间段例如 为18个月、120天、90天、60天、45天、30天、21天、14天、7天、5天、96小时、72小时、48小 时、36小时、24小时、12小时或更短。自获取受试者体液样本起0小时的危险性相当于目前 症状的诊断。
[0037]在优选的危险分级实施方案中，根据受试者预先存在的肾前性、肾性或肾后性ARF的一种或多种已知的危险因素来选择进行危险分级的受试者。例如，正在经历或经历过大 血管手术、冠状动脉搭桥或其它心脏手术的受试者；具有预先存在的充血性心力衰竭、子 痫前期、子痫、糖尿病、高血压、冠状动脉疾病、蛋白尿、肾功能不全、肾小球过滤低于正常 范围、肝硬化、血清肌酐高于正常范围或败血症的受试者；或接触NSAID、环孢菌素、他克莫 司、氨基糖甙类、膦甲酸、乙二醇、血红蛋白、肌红蛋白、异环磷酰胺、重金属、甲氨蝶呤、不透 射线的造影剂或链脲佐菌素的受试者，这些都是优选根据本文中所述的方法监测危险性的 受试者。这份清单并不意味着具有限制的意思。在这种情况下的"预先存在"意指在获取 受试者体液样本时就存在所述的危险因素。在特别优选的实施方案中，根据肾功能损伤、肾 功能衰弱或ARF的现有诊断来选择进行危险分级的受试者。
[0038]在其它实施方案中，本文中所述评价肾状态的方法是诊断受试者肾损伤的方法； 即，评估受