用于评价卵母细胞和胚胎的代谢成像方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 根据35U.S.C. § 119(e)，本申请要求2013年1月8日提交的美国临时申请号 61/750, 061的优先权，以引用的方式将其内容整体并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及用于对卵母细胞和/或胚胎的代谢状况进行评价的方法，并且，本发 明例如可用于在辅助生殖技术中评价卵母细胞和胚胎。
【背景技术】
[0004] 在过去30年里，辅助生殖技术（ART)彻底改变了人类不育（infertility)的治 疗，并且已经变得普遍。目前在美国，ART对超过1%的出生负有责任（SART，2005)。然而， ART的成功率很低，仅有10% -35%的周期实现成功出生，从而导致高成本和使用多个胚 胎，这继而引起多胎妊娠的高发率。多胎妊娠使死亡率以及婴儿和母亲二者的痛苦大大增 加，并产生大量的经济成本。据估算，在美国，每年来自由ART产生的多胎妊娠的并发症导 致约十亿美元的医疗保健费（Bromer和Seli，2008)。
[0005] ART成功率低的主要原因之一在于缺乏可靠的用于选择最高质量的胚胎来转移 (transfer)的方法。缺乏用于对胚胎质量进行评价的方法使得大量努力用来开发改善的 胚胎存活力（viability)的分析。目前用于预测胚胎质量的最可靠的方法是在转移前使用 标准透射光学显微系统对胚胎形态学进行检查，一些医疗机构探索了使用专业显微镜进行 延时成像的应用，例如，Unisense的EmbryoScope或Auxogyn的EPIC。然而，选择标准通 常都是主观的，并且仅产生上文所引述的~35%的成功率。新提出的基于非显微术的方法 (使用基于基因组学、转录组学或蛋白组学的分析（Uyar等，2012))需要胚胎活检，因此是 侵入性的并显著降低了胚胎存活率（Scott等，2006)。最初显示出希望的代谢组学方法是 通过测量胚胎培养介质中代谢物的变化来对胚胎的代谢状态进行分析（Botros等，2008)。 然而，最近，一项前瞻性的随机临床试验并未显示出相比单独的形态学评估，使用此类代谢 组学评价法改善了选择性（Vergouw等，2012)。
[0006] 用于辅助生殖技术的对胚胎或卵母细胞存活力进行评价的最小侵入性的、简单可 靠的方法将在改善母亲和胎儿的安全性方面提供显著优势，并且还将通过减少为达到怀孕 所必须尝试的植入次数以及通过减少多胎妊娠来降低辅助生殖技术的成本。
【发明内容】
[0007] 我们提供了用于对卵母细胞和胚胎质量进行快速测定的集成自动化系统。所述方 法为最小侵入性的。我们发现，使用NADH和/或FAD的荧光寿命成像显微术（FUM)，能够 在无需额外的细胞或细胞培养介质操作的情况下，在体外分析中快速可靠地、并且在大部 分情况下最小侵入性地进行这些细胞的代谢状态的直接分析。
[0008] 因此，我们提供了对卵母细胞和胚胎进行评价的方法，所述方法使用卵母细胞或 完整胚胎、或者使用与卵母细胞相关的颗粒细胞（granulosa cells)或卵丘细胞（cumulus cells)、或来自于胚胎的活检得到的一个或多个细胞，通过用FUM利用来自烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸（NADH)和/或黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD)的自发荧光对它们的代谢状态进行分 析来进行。具有客观测量的足够代谢状态（由蛋白结合的NADH和/或游离NADH的荧光寿 命、或者蛋白结合的FAD和/或游离FAD的荧光寿命表示）的细胞表示可选择用于体外受 精或植入的卵母细胞或胚胎；如果代谢状态不足够，可将该卵母细胞/胚胎从体外受精或 植入中弃去。
[0009] 例如，我们发现，未受干扰的（unperturbed)卵母细胞表现出一定范围的a值和 0值（图1，圆圈）。从图1中可看出，卵母细胞质量取决于卵母细胞的代谢状态。卵母细 胞的代谢状态可通过FAD或NADH的荧光寿命成像显微术（FUM)快速、非侵入性且定量地 测量。从卵母细胞的NADH(或FAD)的FLIM测量中提取两个参数（a和0)。在实例中，我 们使用了小鼠卵母细胞，但由于在这一阶段哺乳动物细胞（例如小鼠细胞和人类细胞）相 对类似，特别是关于它们的代谢状态的方面，预期类似的计算对人卵母细胞也奏效。各点对 应于来自单个卵母细胞的数据。通过特异性代谢抑制剂（黑色十字）或非特异性损伤（三 角）干扰卵母细胞使得两个参数均升高。未受干扰的卵母细胞（圆圈）表现出一定范围的 a值和0值。这些参数表示卵母细胞的质量。
[0010] 可将NADH/FAD自发荧光的寿命与参比分布进行比较，从而提供了对有存活力和 无存活力的卵母细胞/胚胎进行选择的便利方式。
[0011] NADH/FAD的寿命分布可用两个指数（exponentials)之和来近似。参数a为两个 指数的振幅（amplitude)之比，参数0为较长指数的寿命。发现NADH的a和0二者的 升高指示胚胎/卵母细胞中的损伤。因此，通常而言，将具有相比参比值而言升高的a值 和0值的细胞从ART方法中弃去，因为它们将被认为是受损的；选择a值和0值小于参 比值的细胞用于ART方法，因为它们的代谢活性表示健康的活性。
[0012] 根据本发明方法的FLIM测量可在极低水平的照明（illumination)下进行，所述 照明水平远小于目前体外受精临床中用于确定卵母细胞和胚胎的形态学的照明水平。因 此，根据本发明方法进行的FUM测量不会干扰卵母细胞和胚胎，由此能够最大限度地实现 非侵入性。
[0013] 因此，我们提供了用于对卵母细胞或胚胎的质量进行评价的方法，所述方法包括： (a)将测试细胞暴露至荧光寿命成像显微镜（FUM)，以获取关于所述测试细胞的内源NADH 或FAD的自发焚光的焚光寿命直方图（histogram)，所述测试细胞选自于卵母细胞、或卵母 细胞相关的卵丘细胞、或胚胎、或来自于胚胎的细胞；(b)对整个所述测试细胞、或所述测 试细胞的细胞质、或所述测试细胞的线粒体的NADH自发荧光、或FAD自发荧光、或两种自发 荧光的荧光寿命直方图进行平均；（c)将来自所述测试细胞的平均荧光寿命直方图与平均 荧光寿命直方图参比值进行比较，以确定来自所述测试细胞的测量的平均荧光寿命直方图 是否在统计学上不同于所述参比值；以及（d)如果来自所述测试细胞的平均荧光寿命直方 图与所述参比值在统计学上并无不同，则选择该卵母细胞用于体外受精或选择该胚胎用于 植入；以及，如果来自所述测试细胞的平均荧光寿命直方图在统计学上不同于所述参比值， 则将该卵母细胞排除在体外受精之外或将该胚胎排除在植入之外。
[0014] 在本发明所有实施方式的一些方面中，所述方法包括通过将寿命直方图拟合至两 个指数之和来建立统计显著性的步骤，并且所测量的细胞的参数被视为落入在健康细胞中 发现的参数范围内或未落入在健康细胞中发现的参数范围内。
[0015] 在本发明所有实施方式的一些方面中，待在测量值和健康细胞之间比较的参数为 a和0，其中，a被定义为两个指数的振幅之比，0被定义为较长指数的寿命。
[0016] 在本发明所有实施方式的一些方面中，来自健康细胞的最大a值为在1. 0-4. 0范 围内的特定值，健康细胞的相应最大0值在2000pS-3000ps的范围内。
[0017] 在本发明所有实施方式的一些方面中，在双光子荧光激发中使用约740nm的波 长，并使用以约460nm为中心的发射带通滤光器来进行FUM。
[0018] 在本发明所有实施方式的一些方面中，在单光子荧光激发中使用约340nm的波 长，并使用以约460nm为中心的发射带通滤光器来进行FUM。
[0019] 在本发明所有实施方式的一些方面中，FLIM在频域（frequency domain)而非时 域（time domain)中进行。
[0020] 在本发明所有实施方式的一些方面中，在双光子荧光激发中使用约900nm的波 长，并使用以约550nm为中心的发射带通滤光器来进行FUM。
[0021] 在本发明所有实施方式的一些方面中，在单光子荧光激发中使用约450nm的波 长，并使用以约550nm为中心的发射带通滤光器来进行FUM。
[0022] 在本发明的所有方面中，所述方法在体外进行。所述方法的非侵入性性质使得它 们能够在不伤害胚胎或卵母细胞的情况下进行。
[0023] 参考优选实施方式的详细描述和附图，本发明的这些方面和其它方面以及多种优 势和用途将更显而易见。
【附图说明】
[0024] 图1示出了来自小鼠卵母细胞中的NADH的FUM成像的数据。将非线性显微术用 于评价活卵母细胞和活胚胎的质量。将来自各个卵母细胞的FUM曲线拟合至两个指数之 和。参数a为两个指数的振幅之比，参数0为较长指数的寿命（以皮秒计）。各点对应 于来自单个卵母细胞的数据。未受干扰的卵母细胞表现出一定范围的 a值和0值。通过 特异性代谢抑制剂（黑色十字）或非特异性损伤（三角）干扰卵母细胞使得两个参数均升 尚。
【具体实施方式】
[0025] 我们发现，使用卵母细胞、或胚胎、或所述卵母细胞周围的一个或多个卵丘细胞、 或来自于所述胚胎的活检得到的细胞内的细胞代谢物的自发荧光的FUM成像，能够对卵 母细胞或胚胎的代谢状态直接进行评价。然后，可选择具有可接受的代谢情况的卵母细胞 和胚胎用于体外受精或植入，并可将具有异常代谢情况的卵母细胞和胚胎从进一步的辅助 生殖方法中弃去。该方法利用比我们知晓的任何方法的侵入性都要小得多的过程提供了对 胚胎/卵母细胞进行分析的方式。
[0026] 该用于对胚胎质量进行评价的方法对预测哪些胚胎具有最大的植入潜力有用，从 而（i)增加辅助生殖技术的妊娠率；（ii)通过为单个"最佳"胚胎的转移提供证据来降低多 胎妊娠率；以及（iii)恰当地选择合适胚胎用于低温保存（cry〇preservati〇n);以及（iv) 增加来自转基因干预的后代的效率。该用于对胚胎质量进行评价的方法还对评价目前的侵 入性程序对卵母细胞和胚胎的影响或作用有用，所述侵入性程序包括：（i)胞质内精子注 射；以及（ii)用于植入前细胞遗传学诊断的卵裂球活检。
[0027] 在目前的方法中，我们利用FUM，通过直接分析胚胎或卵母细胞、或分析来自胚胎 的细胞、或分析卵母细胞周围的卵丘细胞或颗粒细胞，来对所述胚胎和/或卵母细胞的代 谢状态进行检测。
[0028] 本文使用的"卵母细胞"是指雌性生殖细胞。根据本发明的方法进行分析的卵母 细胞在受精前获得，并且所述分析在体外进行。
[0029] "植入前胚胎（pre-implantation embryo) "或"胚胎"在本文中通常用于指具有 两个原核（pronuclei)(直至囊胚并包括囊胚）、但未被植入雌性生殖道内层的体外受精的 卵母细胞。通常，在一个实施方式中，植入前胚胎包含约2个细胞至约8个细胞（即，在受 精后约18小时至约70小时对胚胎进行评价），但这些范围可在物种间有所变化。通常，人 胚胎或小鼠胚胎的质量评价在包含2-8个细胞的胚胎上进行。
[0030] "来自于胚胎的细胞"是指来自于胚胎的活检得到的单个细胞。胚胎活检是涉及在 将胚胎转移至母亲的子宫之前从该胚胎移出一个或多个细胞的程序。进行该程序通常是用 于测试胚胎的特定遗传紊乱。可在进行遗传分析前对所述细胞进行本发明的方法。
[0031] 考虑到卵丘颗粒细胞和卵母细胞之间密切的物