血清高尔基体蛋白73含量的测定方法和测定试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医疗检测领域，特别涉及一种高尔基体蛋白73测定方法及测定试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 原发性肝癌（PLC)主要包括肝细胞癌（HCC)、肝内胆管细胞癌（ICC)和肝细胞 癌-肝内胆管细胞癌混合型三种类型，是我国常见恶性肿瘤之一。由于起病隐匿，早期没有 症状或症状不明显，进展迅速，确诊时大多数患者已经达到局部晚期或发生远处转移，治疗 困难，预后很差。大量研究表明，高尔基体蛋白73比甲胎蛋白出现时间更早，在早期在诊断 HCC时敏感度明显高于后者，因此2011年国家卫生部已将高尔基体蛋白73测定列入原发性 肝癌诊疗规范。高尔基体蛋白73是存在于高尔基体的一种跨膜蛋白，临床上已逐渐成为诊 断肝癌尤其是早期肝癌的血清标志物。目前主要的高尔基体蛋白73的检测方法主要为转 发光法和酶联免疫法，虽然这两者都能定量的测定人血清中的高尔基体蛋白73的浓度，但 测定过程烦琐，时间较长，人为因素影响大；并且成本较高，需要专用的检测设备。
【发明内容】
[0003] 为了解决上述问题，本发明提供一种高尔基体蛋白73的测定方法及测定试剂盒。 本发明要解决的技术问题是：利用现有的全自动生化分析仪定量、快速、准确地测定人人 血清中的高尔基体蛋白73的浓度。为了实现上述技术目的，本发明的技术方案为：血清高 尔基体蛋白73含量的测定方法，包括以下步骤：
[0004] A.将高尔基体蛋白73单克隆抗体通过化学交联标记在聚苯乙稀纳米颗粒表面， 加入电解质和表面活性剂体系保持悬浊液稳定；
[0005] B.将待测血清加入步骤A所得的悬浊液中，待测血清中的高尔基体蛋白73与所述 悬浊液中的高尔基体蛋白73单克隆抗体进行特异性抗原抗体反应出现凝集而浊度增加， 而聚苯乙烯纳米颗粒可以相应的放大检测信号；
[0006] C.检测所述悬浊液吸光度的变化，通过与校准曲线对照，计算出待测样本中高尔 基体蛋白73的浓度。
[0007] 上述方案中，所述步骤A中的电解质为氯化钠溶液，所述表面活性剂为聚乙二醇 6000 〇
[0008] 上述方案中，所述步骤C中，在570~700nm波长下检测所述悬浊液吸光度的变 化。
[0009] 本发明还公开了血清高尔基体蛋白73含量测定试剂盒，包括试剂RU试剂R2和校 准品，所述试剂Rl包括Tris缓冲液、氯化钠和聚乙二醇6000,所述试剂R2包括Tris缓冲 液、高尔基体蛋白73单克隆抗体和聚苯乙烯纳米颗粒，所述校准品为高尔基体蛋白73校准 液1、2、3、4、5。Rl中的氯化钠和聚乙二醇6000可以保持悬浊液体系的稳定，聚乙二醇6000 还可以促进抗原抗体的结合。
[0010] 上述方案中，所述聚苯乙稀纳米颗粒的粒径为180-210纳米，所述聚苯乙稀纳米 颗粒的质量百分比浓度为1. 5%。。
[0011] 上述方案中，所述Tris缓冲液的摩尔浓度为20mM，所述氯化钠的摩尔浓度为 12mM〇
[0012] 上述方案中，所述聚乙二醇6000的质量百分比浓度为1.8%。
[0013] 上述方案中，所述高尔基体蛋白73单克隆抗体的质量百分比浓度为1%。
[0014] 上述方案中，所述试剂盒还包括质控品，所述质控品为高尔基体蛋白73质控液1、 2、3〇
[0015] 上述方案中，所述试剂Rl和试剂R2中均包括防腐剂，所述防腐剂的浓度为0.1 g/ L0
[0016] 本发明的优点和有益效果在于：本发明提供一种高尔基体蛋白73的测定方法及 测定试剂盒，可以利用现有的全自动生化分析仪定量、快速、准确地测定人人血清中的高尔 基体蛋白73的浓度。
【附图说明】
[0017] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
[0018] 图1为本发明在OLYMPUS AU400/640/2700/5400全自动生化分析仪的参数设定表
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步描述。以下实施例仅 用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0020] 本发明公开了血清高尔基体蛋白73含量的测定方法，包括以下步骤：
[0021] A.将高尔基体蛋白73单克隆抗体通过化学交联标记在聚苯乙稀纳米颗粒表面， 加入电解质和表面活性剂体系保持悬浊液稳定；
[0022] B.将待测血清加入步骤A所得的悬浊液中，待测血清中的高尔基体蛋白73与所述 悬浊液中的高尔基体蛋白73单克隆抗体进行特异性抗原抗体反应出现凝集而浊度增加， 而聚苯乙烯纳米颗粒可以相应的放大检测信号；
[0023] C.检测所述悬浊液吸光度的变化，通过与校准曲线对照，计算出待测样本中高尔 基体蛋白73的浓度。
[0024] 本发明的检测原理为：将高尔基体蛋白73单克隆抗体标记在聚苯乙稀纳米级胶 乳的表面，血清中的高尔基体蛋白73与试剂中的高尔基体蛋白73单克隆抗体在在缓冲体 系中相遇，即结合成抗原-抗体复合物，产生一定浊度，聚苯乙烯纳米级胶乳颗粒可以相应 的增大该浊度变化。在570-700nm波长检测其吸光度的变化，并通过与相应的校准曲线做 对照，可以计算得出血清中高尔基体蛋白73的浓度。
[0025] 本发明还包括一种高尔基体蛋白73的测定试剂盒，包括试剂Rl和试剂R2,其中 试剂Rl包括摩尔浓度为20mM的Tris缓冲液、摩尔浓度为12mM的氯化钠、质量百分比浓度 为I. 8%的聚乙二醇6000以及浓度为0. lg/L的防腐剂；试剂R2包括摩尔浓度为20mM的 Tris缓冲液、质量百分比浓度为1 %高尔基体蛋白73单克隆抗体、粒径为80-210纳米质 量百分比浓度为1. 5%。的聚苯乙烯纳米颗粒以及浓度为0. lg/L的防腐剂；以及高尔基体蛋 白73校准液1、2、3、4、5和高尔基体蛋白73质控液1、2、3。试剂盒内试剂的包装规格为Rl 30ml*l ;R2 试剂盒于2-8°C避光密封保存，自生产之日起可稳定12个月，开封后 在30天内使用完毕。
[0026] 按照图1所示参数表设定奥林巴斯2700全自动生化分析仪，校准品浓度和位置根 据实际情况输入。
[0027] 待测血液样本采集后进行离心处理，取血清待用；按照下表所示方法检测：
[0028] 主波长：600nm反应方法：终点法反应方向：正
[0029]
[0030] 然后通过合适的数学模型（非线性）如Logit-log (4p)或SPLINE拟合多点定标 的校准曲线。样品浓度值通过校准曲线得出。
[0031] 本发明除了适用于奥林帕斯系列全自动生化分析仪，还适用于日立7080、7600 ; 贝克曼CX9、LX20 ;东芝40 ;杜邦RXL ;雅培C8000全自动生化分析仪。
[0032] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 血清高尔基体蛋白73含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤： A. 将高尔基体蛋白73单克隆抗体通过化学交联标记在聚苯乙烯纳米颗粒表面，加入 电解质和表面活性剂体系以保持悬浊液稳定； B. 将待测血清加入步骤A所得的悬浊液中，待测血清中的高尔基体蛋白73与所述悬浊 液中的高尔基体蛋白73单克隆抗体进行特异性抗原抗体反应出现凝集而浊度增加，而聚 苯乙烯纳米颗粒可以相应的放大检测信号； C. 检测所述悬浊液吸光度的变化，通过与校准曲线对照，计算出待测样本中高尔基体 蛋白73的浓度。2. 根据权利要求1所述的血清高尔基体蛋白73含量的测定方法，其特征在于，所述步 骤A中的电解质为氯化钠溶液，所述表面活性剂为聚乙二醇6000。3. 根据权利要求2所述的血清高尔基体蛋白73含量的测定方法，其特征在于，所述步 骤C中，在570~700nm波长下检测所述悬浊液吸光度的变化。4. 血清高尔基体蛋白73含量测定试剂盒，其特征在于，包括试剂RU试剂R2和校准 品，所述试剂Rl包括Tris缓冲液、氯化钠和聚乙二醇6000,所述试剂R2包括Tris缓冲液、 高尔基体蛋白73单克隆抗体和聚苯乙烯纳米颗粒，所述校准品为高尔基体蛋白73校准液 1、2、3、4、5〇5. 根据权利要求4所述的血清高尔基体蛋白73含量测定试剂盒，其特征在于，所述 聚苯乙烯纳米颗粒的粒径为180-210纳米，所述聚苯乙烯纳米颗粒的质量百分比浓度为 1. 5%0〇6. 根据权利要求3所述的血清高尔基体蛋白73含量测定试剂盒，其特征在于，所述 Tris缓冲液的摩尔浓度为20mM，所述氯化钠的摩尔浓度为12mM。7. 根据权利要求4所述的血清高尔基体蛋白73含量测定试剂盒，其特征在于，所述聚 乙二醇6000的质量百分比浓度为1. 8%。8. 根据权利要求4所述的血清高尔基体蛋白73含量测定试剂盒，其特征在于，所述高 尔基体蛋白73单克隆抗体的质量百分比浓度为1%。9. 根据权利要求4~8任一所述的血清高尔基体蛋白73含量测定试剂盒，其特征在 于，所述试剂盒还包括质控品，所述质控品为高尔基体蛋白73质控液1、2、3。10. 根据权利要求9所述的血清高尔基体蛋白73含量测定试剂盒，其特征在于，所述试 剂Rl和试剂R2中均包括防腐剂，所述防腐剂的浓度为0. lg/L。
【专利摘要】本发明公开了血清高尔基体蛋白73含量的测定方法和测定试剂盒。方法包括以下步骤：A.将高尔基体蛋白73单克隆抗体通过化学交联标记在聚苯乙烯纳米颗粒表面，加入电解质和表面活性剂体系以保持悬浊液稳定；B.将待测血清加入步骤A所得的悬浊液中，待测血清中的高尔基体蛋白73与所述悬浊液中的高尔基体蛋白73单克隆抗体进行特异性抗原抗体反应出现凝集而浊度增加，而聚苯乙烯纳米颗粒可以相应的放大检测信号；C.检测所述悬浊液吸光度的变化，通过与标准曲线对照，计算出待测样本中高尔基体蛋白73的浓度。本发明可以利用现有的全自动生化分析仪定量、快速、准确地测定人血清中的高尔基体蛋白73的浓度。
【IPC分类】G01N33/546, G01N33/68, G01N33/577
【公开号】CN105044354
【申请号】CN201510394731
【发明人】董静平
【申请人】董静平
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月2日