一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物显微形态学领域，特别是一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法。
【背景技术】
[0002]单宁即鞣质，指分子量为500-3000的能沉淀蛋白质、生物碱的水溶性多酚化合物。单宁广泛存在于中草药和植物食品，由于具有独特的功能活性，目前植物多酚已广泛应用于医药、食品、制革和日用化工等相关领域，并发挥着不可替代的作用。医药上单宁可止血愈伤，抑菌抗过敏，尤其是具有抗氧化、抗癌变、防止心脑血管疾病的功效，成为近年酚类物质的研究热点。在亚显微结构水平上观察单宁的产生、运输、储存和分布需要做超薄切片。超薄切片要经过染色才能在电镜下显示清晰的结构，自20世纪60年代以来，通常采用醋酸铀-柠檬酸铅双染法进行电子染色，以提高细胞结构成分的反差，增强图象的清晰度，使各种组织成分达到满意的染色效果。然而，醋酸铀和柠檬酸铅不仅价格昂贵，醋酸铀本身具有放射性，光照和高温下不稳定，因此使用时应注意避光，铀也是一种核燃料，醋酸铀的使用在许多国家受到限制。柠檬酸铅毒性大，染色时需注意密封以减少污染，特别是铅染液很容易与空气中CO2分子反应生成碳酸铅沉淀物，造成切片的污染，而且不安全。因此发明一种简便、低廉、安全的用于观察植物中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法，是亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0003]针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法，可有效解决简便、低廉、安全的用于观察植物中单宁类物质分布结构的问题。
[0004]本发明解决的技术方案是，将植物材料在含有咖啡碱和戊二醛的浸渍液中浸渍，再用锇酸固定，乙醇脱水，Epon 812包埋，超薄切片，用绿茶提取液染色，具体步骤是:
(1)、切块:在室温下，将植物切成Imm3的小块，0~4°C保存；
(2)、浸渍和固定:首先配制浸渍液，浸渍液是由pH7.0的磷酸缓冲液、戊二醛、咖啡碱混匀制成，重量百分比为戊二醛3%~9%、咖啡碱0.5-2.5%和余量为pH7.0的磷酸缓冲液(总量100%)，切块置入浸渍液中浸渍2 — 16h，开始时，每0.5-lh更换一次浸渍液，连续更换3次，得浸渍后的切块；浸渍后的切块再置入质量浓度1%~2%的锇酸(OsO4)固定液固定l~2h ；
(3)、漂洗:从锇酸固定液中取出切块，用蒸馏水漂洗5min，去除切块表面的锇酸；
(4)、脱水:在室温下，依次用体积浓度30%乙醇溶液、体积浓度50%乙醇溶液、体积浓度70%乙醇溶液、体积浓度90%乙醇溶液各脱水10~20min，将切块捞出，再用100%乙醇溶液中脱水2-3次，每次10-20min ； (5)、渗透:采用梯度对Epon812渗透，方法是，首先按重量计Epon 812: 100%乙醇为1: 3混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812 ;再以重量计Epon 812: 100%乙醇为1:1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812 ;再以重量计Epon 812:100%乙醇为3: I混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812，35~40°C下静置12h ;
(6)、包埋和聚合:将切块包入胶囊或包埋板中，加入渗透后的Epon812，放烘箱中加热，35°C加热12h，45°C加热12h，60°C加热24h，Epon 812聚合，冷却至室温，成包埋块；
(7)、修块:将包埋块经粗修，修整成梯形；
(8)、切片:将梯形包埋块切成厚度60~80μπι的切片，制干；
(9)、染色:将切片相间隔放在蜡盘上，用吸管吸取体积浓度0.2-0.5%的绿茶提取液，逐滴滴在切片上，盖好錯盘染色10-30分钟；
所述的蜡盘是由培养皿中浇铸融化的石蜡，冷却后制成；
所述的绿茶提取液，取绿茶1kg，粉碎，45-50°C下，用体积浓度70%乙醇8L浸渍30min，过滤，滤液在50°C下用旋转蒸发仪去除乙醇，浓缩得到浸出物，将浸出物在真空干燥箱中40 °C干燥24h，得到粗提物，磨碎，4°C保存，使用时用水稀释成所需体积浓度0.2-0.5%的绿茶提取液；
(10)、漂洗:取出切片，用蒸馏水洗涤三次，滤纸吸出水分，室温晾干；
(11)、镜检:将染色后的切片放入干燥器中干燥，在透射电镜下观察照相，得结构清晰的图像。
[0005]本发明方法简单，易操作，成本低，安全，污染少，成功率高，效果好，有效用于观察植物细胞中单宁类物质分布结构，是植物切片染色上的一大创新，有显著的经济和社会效益。
【具体实施方式】
[0006]以下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0007]实施例1
本发明在具体实施中，由以下步骤实现:
(1)、切块:在室温下，用刀片将植物切成Imm3的小块，0~4°C保存；
(2)、浸渍和固定:首先配制浸渍液，浸渍液是由pH7.0的磷酸缓冲液、戊二醛、咖啡碱混匀制成，重量百分比为戊二醛5-7%、咖啡碱1-2%和余量为pH7.0的磷酸缓冲液(总量100%)，切块置入浸渍液中浸渍2 — 16h，开始时，每0.5-lh更换一次浸渍液，连续更换3次，得浸渍后的切块；浸渍后的切块再置入质量浓度1.5%的锇酸(OsO4)固定液固定l~2h ;
(3)、漂洗:从锇酸固定液中取出切块，用蒸馏水漂洗5min，去除切块表面的锇酸；
(4)、脱水:在室温下，依次用体积浓度30%乙醇溶液、体积浓度50%乙醇溶液、体积浓度70%乙醇溶液、体积浓度90%乙醇溶液各脱水12-18min，将切块捞出，再用100%乙醇溶液中脱水2-3次，每次12-18min ；
(5)、渗透:采用梯度对Epon812渗透，方法是，首先按重量计Epon 812: 100%乙醇为1: 3混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812 ;再以重量计Epon 812: 100%乙醇为1:1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812 ;再以重量计Epon 812:100%乙醇为3: I混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812，35~40°C下静置12h ; (6)、包埋和聚合:将切块包入胶囊或包埋板中，加入渗透后的Epon812，放烘箱中加热，35°C加热12h，45°C加热12h，60°C加热24h，Epon 812聚合，冷却至室温，成包埋块；
(7)、修块:将包埋块经粗修，修整成梯形；
(8)、切片:在切片机上固定好梯形包埋块和切片刀，切成厚度65-75μπι的切片，铜网捞出，制干；
(9)、染色:将放有切片的铜网相间隔放在蜡盘上，用吸管吸取体积浓度0.3-0.4%的绿茶提取液，逐滴滴在切片上，盖好錯盘染色10_30分钟；
(10)、漂洗:取出铜网切片，用蒸馏水洗涤三次，滤纸吸出水分，室温晾干；
(11)、镜检:将染色后的切片放入干燥器中干燥，在透射电镜下观察照相，得结构清晰的图像。
[0008]实施例2
本发明在具体实施中，由以下步骤实现:
(1)、切块:在室温下，用刀片将植物切成Imm3的小块，0~4°C保存；
(2)、浸渍和固定:首先配制浸渍液，浸渍液是由pH7.0的磷酸缓冲液、戊二醛、咖啡碱混匀制成，重量百分比为戊二醛6%、咖啡碱1.5%和余量为pH7.0的磷酸缓冲液(总量100%)，切块置入浸渍液中浸渍2 — 16h，开始时，每0.5-lh更换一次浸渍液，连续更换3次，得浸渍后的切块；浸渍后的切块再置入质量浓度1%~2%的锇酸(OsO4)固定液固定l~2h ;
(3)、漂洗:从锇酸固定液中取出切块，用蒸馏水漂洗5min，去除切块表面的锇酸；
(4)、脱水:在室温下，依次用体积浓度30%乙醇溶液、体积浓度50%乙醇溶液、体积浓度70%乙醇溶液、体积浓度90%乙醇溶液各脱水15min，将切块捞出，再用100%乙醇溶液中脱水2-3次，每次15min ；
(5)、渗透:采用梯度对Epon812渗透，方法是，首先按重量计Epon 812: 100%乙醇为1: 3混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812 ;再以重量计Epon 812: 100%乙醇为1:1混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812 ;再以重量计Epon 812:100%乙醇为3: I混合在一起，对Epon 812渗透12h，捞出Epon 812，35~40°C下静置12h ;
(6)、包埋和聚合:将切块包入胶囊或包埋板中，加入渗透后的Epon812，放烘箱中加热，35°C加热12h，45°C加热12h，60°C加热24h，Epon 812聚合，冷却至室温，成包埋块；
(7)、修块:将包埋块经粗修，修整成梯形；
(8)、切片:在切片机上固定好梯形包埋块和切片刀，切成厚度75μπι的切片，铜网捞出，制干；
(9)、染色:将放有切片的铜网相间隔放在蜡盘上，用吸管吸取体积浓度0.4%的绿茶提取液，逐滴滴在切片上，盖好錯盘染色10-30分钟；
(10)、漂洗:取出铜网切片，用蒸馏水洗涤三次，滤纸吸出水分，室温晾干；
(1