一种快捷测定水中mc-rr的量子点荧光检测方法

文档序号:9348533阅读:460来源:国知局
一种快捷测定水中mc-rr的量子点荧光检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快捷测定水中MC-RR的量子点荧光检测方法,属于分析化学检测 领域。
【背景技术】
[0002] 微囊藻毒素(MC)具有肝毒性、肾毒性、神经毒性、免疫毒性及生殖毒性,也是确认 的肝癌促进剂。藻毒素的结构为环状七肽,已知超过60种结构变异体,含量相对较多、毒性 较大的几种为:LR、RR及YR。MC-RR毒性虽然比MC-LR小,但它含量高,危害甚至比MC-LR大, 而且国内还未将MC-RR作为监测指标。对于MC-RR的检测研究相对较少,目前以HPLC-MS、 HPLC法为主。但因HPLC-MS法仪器昂贵,样品制备过程复杂、耗时长,检测费用高,且对操作 人员要求也较高;HPLC法灵敏度达不到要求,需要浓缩样品,前处理繁琐,且产生大量有毒 的有机废液,耗人力、耗时、费钱。这限制了这两种方法在基层检测机构中的推广应用。因 此,开发出一种快捷、廉价、简便且高灵敏度的检测水及水产品中的MC-RR方法很有必要。

【发明内容】

[0003] 本发明的目的在于建立一种快捷、廉价、简便且高灵敏度的检测水中MC-RR的方 法。
[0004] 按照本发明提供的技术方案:一种快捷测定水中MC-RR的量子点荧光检测方法, 步骤如下: (1) 制备水溶性核壳式结构的CdSe/CdS量子点 取合成的有机相CdSe/CdSlmL,用20yL巯基乙酸转相,正己烷洗涤,干燥,得到CdSe/CdS量子点(QDs)粉末;称取20mgCdSe/CdS量子点粉末溶于pH= 7. 17的10mL0.02mol/ L的PBS缓冲溶液中,即得到2.Omg/mL水溶性的CdSe/CdS量子点QDs; (2) 制备QDs-MC-RR抗体生物共辄体及反应条件的优化 将 2mgEDC、0. 5mgNHS和 40ML2.Omg/mL的QDs混合于 2mL0? 02mol/LpH为 7. 17 的PBS缓冲溶液中,混匀后于室温下孵育30min,加入2ML疏基乙酸终止活化反应,5min后向 活化好的QDs溶液中加入IOMLlOnmol/LMC-RR单克隆抗体(苏州科同生物医药科技有限 公司),37°C恒温震荡培养lh,加入IOML0. 04mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液终止反应。 再用100KD的超滤膜离心管1000 Orpm离心纯化得到QDs-MC-RR生物共辄体,加入5ML5% 牛血清蛋白溶液封闭; 检测MC-RR反应条件:PBS缓冲溶液pH为7. 17,反应时间60min,反应温度37°C,QDs浓度 2.Omg/mL; (3) 检测MC-RR标准曲线的建立 向上述2mLQDs-MC-RR生物共辄体溶液中加入10ML不同浓度的MC-RR,分别为 0.0nmol/L、0.5nmol/L、1.0nmol/L、2.0nmol/L、3.0nmol/L、4.0nmol/L的标准系列,在 400nm激发波长下QDs-MC-RR生物共辄体的荧光猝灭程度与MC-RR浓度的关系:该生物共 辄体系的荧光强度与MC-RR浓度在一定范围内呈线性相关关系,且符合Lambert-Beer公 式: (F0-Fn) /F0=O. 1103C+0. 02293 (r=0. 99460) F。为未加入MC-RR时QDs-MC-RR生物共辄体的荧光强度;Fn为加入MC-RR后QDs-MC-RR生物共辄体的荧光强度;C为加入MC-RR样品的浓度,单位:nmol/L; (4)方法精密度及检出限 MC-RR浓度分别为0. 5nmol/L、2. 0nmol/L、4.Onmol/L时平行测定7次,精密度RSD分别为11. 3%、5. 6%、4. 2% ;MC-RR浓度为0. 25nmol/L时平行测定11次,方法的检出限为 2. 4X10 10mol/L〇
[0005] 本发明的有益效果:本发明提供的快捷测定水中MC-RR的量子点荧光检测方法与 常用的HPLC-MS、HPLC等检测方法相比,廉价、简便,配上便携式荧光仪可用于现场检测。
【附图说明】
[0006] 图1 :水溶性CdSe/CdS量子点的TEM图。
[0007] 图2:QDs与QDs-MC-RR生物共辄体的吸收光谱。
[0008] 图3:QDs与QDs-MC-RR生物共辄体的荧光光谱。
[0009] 图4 :不同MC-RR浓度下生物共辄体荧光光谱图,a-f?浓度分别为0. 0,0. 5,1. 0, 2. 0, 3. 0,4. 0nmol/L〇
【具体实施方式】
[0010] 实施例1 一种快捷测定水中微囊藻毒素-RR的量子点荧光检测方法,包括如下步 骤: 1、 制备水溶性核壳式结构的CdSe/CdS量子点 取20mmolCdO(氧化锦)置于三颈烧瓶中,加入9.6mL油酸和40mL液体石錯,搅拌 加热到220°C,作为镉源。取Immol硒粉加到50mL液体石蜡中,搅拌并缓慢加热到220°C, 作为硒源。取5mL的镉源,剧烈搅拌下快速注入到硒源中,维持溶液温度在220°C,加热30 min得到CdSe量子点。然后降温到100 °C,并向其中通入H2S气体,磁力搅拌。反应结束, 温度缓慢升高到220 °C,回流30min,得到有机相核壳式CdSe/CdS量子点,(参照文献Deng 等发表于J.Phys.Chem.B, 2005,109 (9): 16671)〇
[0011] 取合成的有机相CdSe/CdSlmL,用20yL巯基乙酸转相,正己烷洗涤,干燥,得 到CdSe/CdS量子点QDs粉末;称取20mgCdSe/CdS量子点粉末溶于pH= 7. 17的10mL 0. 02mol/L的PBS缓冲溶液中,即得到2.Omg/mL水溶性的CdSe/CdS量子点QDs; 2、 制备QDs-MC-RR生物共辄体及反应条件的优化 将 2mgEDC、0. 5mgNHS和 40ML2.Omg/mL的QDs混合于 2mL0? 02mol/LpH为 7. 17 的PBS缓冲溶液中,混匀后于室温下孵育30min,加入2ML巯基乙酸终止活化反应,5min后向活 化好的QDs溶液中加入10ML10nmol/LMC-RR单克隆抗体,37°C恒温震荡培养lh,加入10ML 0. 04mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液终止反应。再用100KD的超滤膜离心管1000 Orpm离 心纯化得到QDs-MC-RR生物共辄体,加入5ML5%牛血清蛋白溶液封闭。
[0012] 优化影响生物共辄体荧光猝灭的因素,得到检测MC-RR最佳实验条件:pH= 7. 17, 反应时间60min,反应温度37°C及CdSe/CdS量子点浓度2.Omg/mL。
[0013] 3、检测MC-RR标准曲线的建立 向上述2mLQDs-MC-RR生物共辄体溶液中加入IOML不同浓度的MC-RR,分别为 0? 0nmol/L、0. 5nmol/L、l. 0nmol/L、2. 0nmol/L、3. 0nmol/L、4.Onmol/L的标准系列。在 400nm激发波长下QDs-MC-RR生物共辄体的荧光猝灭程度与MC-RR浓度的关系:该生物共 辄体系的荧光强度与MC-RR浓度在一定范围内呈线性相关关系,且符合Lambert-Beer公 式: (F0-Fn) /F0=O. 1103C+0. 02293 (r=0. 99460) F。为未加入MC-RR时QDs-MC-RR生物共辄体的荧光强度;Fn为加入MC-RR后QDs-MC-RR生物共辄体的荧光强度;C为加入MC-RR样品的浓度(单位:nmol/L)。
[0014] 4、方法精密度及检出限 按实验方法对〇. 5nmol/L、2. 0nmol/L、4.Onmol/LMC-RR标准溶液分别平行测定7次, 得出低、中、高MC-RR浓度时,本方法的精密度分别为RSD=IL3%、5. 6%、4. 2%。对0. 25nmol/ LMC-RR标准溶液平行测定11次,得到本方法的检出限达到2.4X101(]m〇l/L。
[0015] 5、实际样品的测定及加标回收实验 取水样用〇. 45Mm超滤膜过滤后加入到QDs-MC-RR生物共辄体中,测其荧光强度的猝 灭,求出水样中MC-RR的含量,若水样中MC-RR含量较高,则适当稀释后进行测定。同时,进 行了MC-RR低中高三种浓度的加标回收实验,结果如表1所示: 表1
【主权项】
1. 一种快捷测定水中MC-RR的量子点荧光检测方法,其特征在于步骤如下: (1) 制备水溶性核壳式结构的CdSe/CdS量子点 取合成的有机相CdSe/CdS lmL,用20 y L巯基乙酸转相,正己烷洗涤,干燥,得到CdSe/ CdS量子点QDs粉末;称取20 mg CdSe/CdS量子点粉末溶于pH= 7. 17的10 mL 0. 02mol/ L的PBS缓冲溶液中,即得到2. Omg/mL水溶性的CdSe/CdS量子点QDs ; (2) 制备QDs-MC-RR生物共辄体及反应条件的优化 将 2mg EDC、0. 5mg NHS 和 40ML 2. Omg/mL 的 QDs 混合于 2mL 0? 02mol/L pH 为 7. 17 的 PBS缓冲溶液中,混匀后于室温下孵育30min,加入2ML巯基乙酸终止活化反应,5min后向活 化好的QDs溶液中加入IOML 10nmol/L MC-RR单克隆抗体,37°C恒温震荡培养lh,加入IOML 0. 04mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液终止反应;再用100KD的超滤膜离心管1000 Orpm离 心纯化得到QDs-MC-RR生物共辄体,加入5ML 5%牛血清蛋白溶液封闭; 检测MC-RR反应条件:PBS缓冲溶液pH为7. 17,反应时间60min,反应温度37°C,QDs 浓度 2. Omg/mL ; (3) 检测MC-RR标准曲线的建立 向上述2mL QDs-MC-RR生物共辄体溶液中加入10ML不同浓度的MC-RR,分别为 0.0nmol/L、0.5nmol/L、1.0nmol/L、2.0nmol/L、3.0nmol/L、4.0nmol/L 的标准系列,在 400nm激发波长下QDs-MC-RR生物共辄体的荧光猝灭程度与MC-RR浓度的关系:该生物共 辄体系的荧光强度与MC-RR浓度在一定范围内呈线性相关关系,且符合Lambert - Beer公 式: (F0-Fn) /F0=O. 1103C+0. 02293, r=0. 99460 ; F。为未加入MC-RR时QDs-MC-RR生物共辄体的荧光强度;F n为加入MC-RR后QDs-MC-RR 生物共辄体的荧光强度;C为加入MC-RR样品的浓度,单位:nmol/L ; (4) 方法精密度及检出限 MC-RR浓度分别为0. 5nmol/L、2. 0nmol/L、4. Onmol/L时平行测定7次,精密度RSD 分别为11. 3%、5. 6%、4. 2% ;MC-RR浓度为0. 25nmol/L时平行测定11次,方法的检出限为 2. 4X10 10 mol/L〇
【专利摘要】本发明涉及一种快捷测定水中微囊藻毒素-RR(MC-RR)的量子点荧光检测方法,属于分析化学检测领域。该方法利用EDC和NHS活化水溶性核壳式CdSe/CdS量子点(QDs)使之与MC-RR单克隆抗体进行共价连接,形成QDs-MC-RR生物共轭体。在优化后的反应条件下,将不同浓度的MC-RR加入到生物共轭体中,发生荧光猝灭现象,荧光猝灭程度与MC-RR的浓度呈一定相关。该方法快捷、廉价、简便且高灵敏度,可直接应用于水中MC-RR的测定。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105067582
【申请号】CN201510460434
【发明人】孟元华, 凌霞, 龚燕, 朱鹏飞, 徐志飞
【申请人】无锡市疾病预防控制中心
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月31日
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