人胰岛素及类似物或偶联物体外生物活性测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于人胰岛素及类似物或偶联物体外生物效价测定检测技术领域，包括 速效胰岛素如门冬胰岛素 （Insulin aspart)、赖脯胰岛素 （Insulin Lispro)、赖谷胰岛素（ Insulin Glulisine),长效胰岛素如甘精胰岛素 （Insulin glargine)、地特胰岛素 （Insulin Detemir)、德谷胰岛素 （Insulin Degludec)以及修饰偶联物如聚乙二醇化胰岛素(如 PEG-Lispro, PEG-Insulin)和 PEG-Insulin (PEG conjugated des B30_insulin)的体外生 物效价测定方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质刺激而分泌的一种蛋白质激素， 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素。胰岛素主要促进肝细胞、肌细胞、脂肪细胞对葡萄糖 的摄取和利用，促进肌肉、脂肪组织等靶细胞的细胞膜载体将血液中的葡萄糖转运入细胞， 转变为脂肪酸作为糖原贮存，同时加速氧化葡萄糖为高能磷酸化合物作为能量的来源，从 而使血糖水平下降，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。胰岛素作为糖尿病治疗的主要药物， 可有效调节人体血糖水平。
[0003] 胰岛素制剂根据胰岛素作用起效的快慢、持续时间的长短，可以分为三大种类： (1)速效人胰岛素类似物：包括门冬胰岛素、赖脯胰岛素和赖谷胰岛素；（2)中效胰岛素：包 括普通胰岛素、中性胰岛素；（3)长效人胰岛素：包括甘精胰岛素、地特胰岛素和德谷胰岛 素。为了适应不同糖尿病人的治疗需要，其中有的短中长效制剂或加入辅助治疗制剂(鱼精 蛋白、锌离子）或进行不同比例的预混型胰岛素提高其治疗效果。 人胰岛素及类似物或偶联物注射液能实现不同时间内的有效控制血糖的水平，如制品 中效价测定不准确，会产生低血糖反应症状，人胰岛素及类似物或偶联物药物治疗研究过 程中生物效价准确性尤为重要。目前国际上针对人胰岛素及类似物或偶联的生物效价测定 是动物体内法，主要包括小鼠和家兔的体内血糖浓度变化的生物效价分析方法，如中国药 典的双交叉小鼠法和美国药典的家兔降血糖法。胰岛素的生物效价目标单位定义法为：家 兔注射最小质量人胰岛素，血糖值达到2. 5mmol/L为1单位效价。各种短中长效人胰岛素及 制剂的生物效价均采用此定义法表示，测定时用胰岛素效价标准品进行交叉比对计算而得 效价，常规制剂中每ml注射液按100单位标示，而非质量来标示，在胰岛素原料和制剂中， 由于尚无有效可靠的体外细胞法来分析检测生物效价的方法，常用已知1单位效价的质量 反应生物效价。如普通胰岛素的1单位效价相当于0. 〇3846mg，地特胰岛素的1单位效价 相当于0. 142mg，由于胰岛素属于生物制品，特别在制剂中可能出现因物理、化学等影响稳 定性的因素，造成生物效价的改变，如单独用质量换算而成的生物效价会出现明显误差，因 此，人胰岛素及制剂需要建立一种体外准确生物活性或效价的分析测定方法。
[0004] 国内外文献报道人胰岛素体外效价测定方法有大鼠原代成熟脂肪细胞法和 3T3-L1前脂细胞诱导脂肪细胞法。大鼠原代提取的成熟脂肪细胞法是利用3H标记的葡萄 糖来检测成熟脂肪细胞葡萄糖利用率，测定胞内同位素分析生物效价。由于原代成熟脂肪 细胞极容易破碎、无法有效计数和重复性差，该方法只有诺和诺德公司用于地特胰岛素质 量研究文献中有过报道。3T3-L1前脂细胞诱导脂肪细胞法由于诱导率低、诱导过程中容易 发生细胞脱落、孔间诱导成功的脂肪细胞不均匀等原因仅停留于胰岛素论文研究中。本专 利创新性地建立了一种稳定、敏感和可重现的原代前脂肪细胞诱导分化成脂肪细胞后采用 非同位素标记的葡萄糖利用率的变化与一定浓度范围梯度的人胰岛素及类似物或偶联物 间的线性关系，可准确计算并评价人胰岛素制品的体外生物活性效价。
[0005]
【发明内容】
[0006] 本发明涉及人胰岛素制品的生物效价测定方法技术，提供了一种实用、准确性高、 重现性好的人胰岛素制品的体外生物效价测定方法及应用。
[0007] 解决本发明技术问题所采用的技术方案是人胰岛素及类似物或偶联物体外生物 效价测定方法，包括如下步骤： (a)提取雄性大鼠腹部沟、附睾、肾周围脂肪垫的脂肪细胞，分离前脂肪细胞。
[0008] (b)用DMEM完全培养液含终浓度为0. 2~lmmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、 0. 5~2 μ mol/L地塞米松和2~10 μ g/mL人胰岛素的诱导剂I诱导前脂肪细胞48~72 小时。
[0009] 再用DMEM完全培养液中含终浓度为2~10 μ g/mL人胰岛素的诱导分化剂II诱导 分化培养48~72小时。
[0010] (c)诱导分化成脂肪细胞后，经饥饿培养24小时，加入不同浓度梯度的人胰岛素 样品，37°C 5%C02反应6-12小时。
[0011] (d)直接取培养上清5~20 μ 1加入含微量葡萄糖氧化酶的反应体系中，37°C反 应10分钟，用490~540nm测定吸光值来获及葡萄糖消耗利用率。
[0012] (e)根据不同浓度人胰岛素待测样品的培养液中葡萄糖消耗利用率与平行测定中 的人胰岛素效价标准品进行计算，获及待测人胰岛素及类似物或偶联物的生物效价单位。
[0013] 本发明是根据人胰岛素及类似物或偶联物刺激脂肪细胞转运葡萄糖的原理，经建 立的方法研究证明，人胰岛素在一定浓度梯度范围内和葡萄糖消耗利用率间呈良好的剂量 线性关系。利用葡萄糖氧化酶代替3H标记葡萄糖测定胞内葡萄糖的分解变化，测定诱导分 化脂肪细胞的细胞培养液葡萄糖含量变化，可准确敏感计算出人胰岛素及类似物或偶联物 生物效价。葡萄糖氧化酶法其原理为：葡萄糖氧化酶利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸， 并释放过氧化氢；过氧化物酶在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧，并使色原 性氧受体4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即Trinder反应。红色醌类化 合物的生成量与葡萄糖含量成正比。本发明利用其原理可准确地测定细胞培养液中的葡萄 糖消耗变化。本发明已具有生物制品体外生物效价测定方法的操作步骤简便、无污染、低成 本、准确性高、重复性好等要求。
[0014]
【附图说明】
[0015] 图I 3T3-L1前脂肪细胞和大鼠前脂肪细胞的GOD-POD法测定重组人胰岛素体外 生物活性 图2大鼠原代成熟脂肪细胞3H-gluc〇se放射法测定重组人胰岛素体外生物活性 图3葡萄糖氧化酶法测定重组人胰岛素和地特胰岛素的体外生物活性 图4 3H-Gluc〇se放射测定法测定重组人胰岛素和地特胰岛素体外生物活性 图5重组人胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素和PEG及修饰偶 联物（PEG-Lispro)体外活性测定
【具体实施方式】
[0016] 以下是本发明的非限定实施例，将有利于本领域的普通技术人员进一步理解本发 明。
[0017] 实施例1重组人普通胰岛素体外生物效价测定的三种测定方法比较 采用3T3-L1前脂肪细胞(购自中国科学院上海细胞库)和雄性大鼠前脂肪细胞(购自雄 性大鼠购自第三军医大学大坪医院动物所）测定重组人胰岛素活性的方法，重组人普通胰 岛素标准品(来源于中国食品药品检定研究院，每支标示含量为20mg/支28. 3IU/mg)。
[0018] 大鼠前脂肪细胞GOD-POD法 (1)取普通食物喂养的90g~120g的雄性大鼠，乙醚麻醉后断头处死，放入75%酒精浸 泡完全消毒，无菌条件下切取腹部沟、附睾、肾周围脂肪垫放入培养皿的PBS中，用手术剪 刀尽量除去血管及淋巴结，然后用PBS液冲洗3次。充分剪碎所取脂肪组织成lmm3，加入浓 度为0. 5mg/ml I型胶原酶消化液，37°C水浴中振荡消化1小时。取DMEM完全培养液20ml 加入组织块中，用吸管反复吹打。然后100目网筛过滤，1200g离心10min。离心后将上层 含成熟脂肪细胞的脂肪层取入新离心管中备用，再弃掉消化液，加入DMEM完全培养液重悬 沉淀细胞，重复操作二次后，取含前脂肪细胞的细胞沉淀经细胞计数后，以2. 5~3. 5 X 105 个/ml加入48孔细胞板20〇μ1/孔，置37°C，5% C02培养24小时。待细胞汇合率达到90% 以上后开始诱导。
[0019] (2)弃培养上清，加入用DMEM完全培养基配制终浓度为0. 5mmol/L 3-异丁 基-1-甲基黄嘌呤、Ιμπιο?/L地塞米松和lOyg/mL胰岛素的诱导溶液I 20〇μ1/孔，置 37°C，5%C02培养48~72小时。
[0020] (3)弃细胞液，加入用DMEM完全培养液配制终浓度为10 μ g/mL胰岛素的诱导剂 II 20〇μ1/ 孔，置 37°C，5%C02 培养 48 ~72 小时。
[0021] (4)弃细胞液，加入DMEM完全培养基20〇μ1/孔，置37°C，5%C02培养48小时。
[0022] (5)弃细胞液，加入含1%FBS的DMEM细胞饥饿液20〇μ1/孔，置37°C，5%C02培养 24小时。
[0023] (6)重组人普通胰岛素的配制：用含1.0 mg/ml葡萄糖的DMEM稀释液逐步稀释至 5ug/ml后，再按3倍倍比稀释，共8个稀释度。
[0024] (7)弃细胞培养液，加入1.0 mg/ml葡萄糖的DMEM的细胞维持液18〇μ1/孔，再加入 配制的胰岛素样品20 μL/孔37°C 5%C02反应10小时。
[0025] (8)取培养上清20 μ 1加入酶标反应板中，再加入葡萄糖氧化酶200 μ 1/孔，置 37°C反应10分钟后。用酶标仪5IOnm测定OD值。
[0026] 大鼠成熟脂肪细胞3H_glucose放射法 (I) I