食品中多种氨基酸的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种食品中多种氨基酸的检测方法以及茚三酮柱后衍生-高效液相 色谱法在检测酒类中多种氨基酸中的应用。
【背景技术】
[0002] 近几年中国食品安全问题频繁出现。2007年"人造蜂蜜"事件，一些不法分子在 假蜂蜜中加入增稠剂、甜味剂、防腐剂、香精和色素等化学物质，假蜂蜜几乎没有营养价值； 2008年的工业原料违法添加事件："苏丹红鸭蛋"、"三聚氰胺牛奶"。"三聚氰胺"事件是震 惊世界的食品安全事件，在随即掀起的行业整肃风暴中，公众不得不接受这样的现实：奶源 造成的质量问题普遍存在于全行业，大企业、知名品牌的问题尤其集中，中国乳业承受了空 前的行业危机，在世界范围造成了恶劣的影响；2010年的"一滴香"泛滥和"地沟油"风波等 食品安全事件。针对上述情况，国家质量监督部门下了很大力气进行监督、检验，但许多问 题仍然未能解决。
[0003] 检验数据能间接反应产品的质量状况，是质监部门对食品企业监管的有力手段。 目前国家标准中仅对食品的基本理化和卫生指标进行检测，不能全面反应食品的品质，一 些不法商贩抓住检测的漏洞，违背食品添加剂的使用原则，添加可能对人体健康造成危害 的工业原料和掩盖食品腐败变质的不得添加的物质。研究能反应广品品质的新的指标和相 应的检测方法，改进原有的检测方法是今后食品监管工作的重点。
[0004] 蛋白质是维持人体正常代谢重要的营养物质，大多数食品标准都规定蛋白质的含 量，传统蛋白质的检测方法是凯氏定氮法。该方法存在多种弊端，检测数据不能全面代表产 品的蛋白质含量，不能区分是产品中应有的蛋白质含量还是人为添加的高含氮物质，如三 聚氰胺。氨基酸是生物体中重要的生命物质，是组成蛋白质的基本单元。检测多种氨基酸 的种类和含量能直接反应产品的品质，对食品品质和食品的掺假检测具有重要的意义。目 前新修订的国家标准方法中可能增加氨基酸检测项目，如新版国家标准方法GB/T 18187 《酿造食醋》修订讨论稿中增加氨基酸（亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸）含量范围，区别固态发酵 食醋与液态发酵食醋。
[0005] 氨基酸（amino acid)是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大 分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。是含有一个碱性氨 基和一个酸性羧基的有机化合物，氨基连在α-碳上。天然的氨基酸现已经发现的有300 多种，其中人体所需的氨基酸约有22种，分非必需氨基酸和必需氨基酸（人体无法自身合 成）。另有酸性、碱性、中性、杂环分类，是根据其化学性质分类的。各种氨基酸在生物体中 具有不同的生物功能，如生物体中的色氨酸与脑的正常代谢有密切的关系，L-半胱氨酸能 增强生物体的抗病能力，因此，准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具 有十分重要的意义。
[0006] 目前食品品质的检测手段还不是特别完善，一些不法商贩为了降低食品成本，降 低原料的使用量，通过添加某些添加剂达到日常监管工作中某些指标的含量，但产品中氨 基酸的种类和含量与正常产品具有明显差异，我们可以通过本发明的方法对食品中氨基酸 的种类和数量进行检测，从而分析食品品质，达到风险预警的效果。为监管部门执法工作提 供有力的技术支撑。
[0007] 目前依据国家标准方法GB/T 5009. 124-2003,利用氨基酸分析仪只能测定食物中 16种氨基酸的含量，并且氨基酸自动分析仪专一性强，价格昂贵，普及性不强，检测氨基酸 的种类少，远远不能满足实际工作的需要，开发出多种氨基酸的检测方法是亟待解决的问 题。
【发明内容】
[0008] 本发明针对现有的国家标准方法只能测定食物中16种氨基酸的含量的缺陷，提 供一种对食品中多种氨基酸类物质（多达30多种）的快速检测方法，即茚三酮柱后衍 生-高效液相色谱法。
[0009] 本发明提供一种食品中多种氨基酸的检测方法，其特征在于，使用高效液相色谱 仪和氨基酸柱后衍生装置来检测食品中的多种氨基酸，其中，
[0010] ⑴色谱条件：
[0011] A、色谱柱采用：
[0012] 预柱：阳离子交换锂保护柱，内径2. 0 X 20mm，5 μ m
[0013] 分析柱：高效阳离子交换锂柱，内径4. 0X100mm，5ym
[0014] B、流动相为：锂离子洗脱液 Li275 (ρΗ2· 75)、Li750 (ρΗ7· 50)
[0015] 梯度洗脱程序为：
[0016]
[0017] C、流速：0· 37mL/min，进样量 20μ L
[0018] D、柱温程序
[0019]
[0020] (2)柱后衍生条件：
[0021] A、柱后衍生反应温度：125°C
[0022] B、柱后衍生反应容量：0. 5mL
[0023] C、柱后衍生试剂：茚三酮试剂
[0024] D、流速：0· 3mL/min。
[0025] 本发明还提供一种茚三酮柱后衍生-高效液相色谱法在检测酒类中多种氨基酸 中的应用，其特征在于，所述茚三酮柱后衍生-高效液相色谱法为本发明提供的食品中多 种氨基酸的检测方法。
[0026] 本发明提供的方法能够同时检测食品中三十多种氨基酸，方法通用性强，可以应 用于不同食品中氨基酸检测。并且由于衍生化反应发生在氨基酸与其他物质分离之后，因 而避免了其他物质的干扰，适合未知复杂样品中多种氨基酸的分析。
[0027] 通过本发明的研究，建立起多种氨基酸类物质的快速检测方法，为食品中氨基酸 类物质的国标修订提供建议，为质监部门识别掺假物质提供技术手段，为食品预警工作提 供技术支撑。
【附图说明】
[0028] 图1为氨基酸混合标准溶液中牛磺酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0029] 图2为氨基酸混合标准溶液中尿素的峰面积-浓度标准曲线图。
[0030] 图3为氨基酸混合标准溶液中天冬氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0031 ] 图4为氨基酸混合标准溶液中羟脯氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0032] 图5为氨基酸混合标准溶液中苏氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0033] 图6为氨基酸混合标准溶液中丝氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0034] 图7为氨基酸混合标准溶液中天冬酰胺的峰面积-浓度标准曲线图。
[0035] 图8为氨基酸混合标准溶液中谷氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0036] 图9为氨基酸混合标准溶液中肌氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0037] 图10为氨基酸混合标准溶液中氨基乙酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0038] 图11为氨基酸混合标准溶液中丙氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0039] 图12为氨基酸混合标准溶液中瓜氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0040] 图13为氨基酸混合标准溶液中α基氨基丁酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0041 ] 图14为氨基酸混合标准溶液中缬氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0042] 图15为氨基酸混合标准溶液中胱氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0043] 图16为氨基酸混合标准溶液中蛋氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0044] 图17为氨基酸混合标准溶液中异亮氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0045] 图18为氨基酸混合标准溶液中亮氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0046] 图19为氨基酸混合标准溶液中酪氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0047] 图20为氨基酸混合标准溶液中苯丙氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0048] 图21为氨基酸混合标准溶液中β基丙氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0049] 图22为氨基酸混合标准溶液中β基氨基丁酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0050] 图23为氨基酸混合标准溶液中Y -氨基丁酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0051 ] 图24为氨基酸混合标准溶液中色氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0052] 图25为氨基酸混合标准溶液中乙醇胺的峰面积-浓度标准曲线图。
[0053] 图26为氨基酸混合标准溶液中羟赖氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0054] 图27为氨基酸混合标准溶液中氨的峰面积-浓度标准曲线图。
[0055] 图28为氨基酸混合标准溶液中赖氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0056] 图29为氨基酸混合标准溶液中组氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
[0057] 图30为氨基酸混合标准溶液中肌肽的峰面积-浓度标准曲线图。
[0058] 图31为氨基酸混合标准溶液中精氨酸的峰面积-浓度标准曲线图。
【具体实施方式】
[0059] 本发明中所使用的高效液相色谱仪可以使用任意的高效液相色谱仪，本发明中优 选使用日本岛津液相色谱仪。
[0060] 本发明中所使用的氨基酸柱后衍生装置优选购自Pickering公司的氨基酸柱后 衍生装置。
[0061] 本发明中使用的预柱为阳离子交换锂保护柱，内径2. OX 20mm，5 μ m，优选为购自 Pickering 公司的 Pickering Laboratories Catalog No. 0352020。
[0062] 本发明中使用的分析柱为高效阳离子交换锂柱，4. OX 100mm，5 μ m ;优选为购自 Pickering 公司的 Pickering Laboratories Catalog No. 0354100T。
[0063] 本发明中使用的流动相为：锂离子洗脱液Li275(pH2.75)、Li750(pH7.50)，优 选为购自Pickering公司的锂离子洗脱液，其中，Li275(pH2. 75)为：水98.4%，柠檬酸锂 〇· 7%，氯化锂 0· 6%，环丁砜 0· 2%，苯甲酸 0· l%;Li750(pH7. 50)为：水 97%，氯化锂 2%， 柠檬酸锂0. 9 %，苯酚0. 1 % (以上均为质量百分含量）。
[0064] 本发明中使用的柱后衍生试剂为讳三酮试剂，优选为购自Pickering公司的讳三 酮试剂，其为：水43. 5%、环丁砜39%、乙酸锂15%、茚三酮1. 5%、还原茚三酮1% (以上 均为质量百分含量）。
[0065] 本发明提供的食品中多种氨基酸的检测方法还包括，在检测前对食品进行前处 理；所述前处理包括：用水将食品样品稀释10倍，过0. 2 μ m滤膜。具体地，可以取食品样 品如酒类样品10mL，置于IOOmL容量瓶中，用水定容至刻度。在8000r/min的速度下离心 IOmin,取上清液，过0. 2 μ m滤膜。
[0066] 在本发明中，所述食品可以为任意食品，优选为酒类，更优选为黄酒。