一种检测肟基乙酸酯类杀菌剂的elisa方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测肟基乙酸酯类杀菌剂的人工抗原合 成及ELISA检测方法。
【背景技术】
[0002] 肟基乙酸酯类杀菌剂属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的一类，杀菌谱广，安全高效。 虽然这类农药毒性低，但因用量逐年增加，仍旧存在安全风险。因此国内外仍然对其在食品 中的残留进行了监控并制定了严格的限量标准，造成我国农产品出口壁垒，影响我国的出 口经济形势。
[0003] 当前，该类杀菌剂常用的气相、液相等仪器检测方法灵敏度高、准确性好、检查范 围广，且已有较为成熟的检测标准，但是所需仪器昂贵、样品前处理时间较长，不适于现场 监测。
[0004] 免疫检测方法（immunoassay, IA)也具有灵敏度高、特异性强的特点，并且可以克 服繁杂的前处理步骤，广泛运用于现场检测，是目前食品安全快速检测的重要方法之一，在 食品安全检测中发挥着越来越重要的作用。
[0005] 因此有必要开发一种免疫技术用于检测肟基乙酸酯类的甲氧基丙烯酸酯类杀菌 剂。本发明主要选取醚菌酯和肟菌酯为代表，进行ELISA方法的建立。
[0006] 肟基乙酸酯类杀菌剂的毒杀基为甲氧亚胺基乙酸甲酯，而（E)-2-(2-溴甲基苯 基）-2-甲氧亚氨基乙酸甲酯（OEBr)是一种常见的农药中间体（图1，分子量< 1000)，结 构中包含肟基乙酸酯类杀菌剂的活性官能团，因此将其作为半抗原合成原料之一与巯基丙 酸（图2)合成肟基乙酸酯类杀菌剂的人工半抗原（AR)。该半抗原仍是一种小分子物质，没 有免疫原性，须与大分子载体（蛋白）等偶联得到人工抗原后，才可以作为动物免疫原料， 制备多克隆抗体。
[0007] 本发明根据以合成的与肟基乙酸酯类杀菌剂的化学结构类似的人工半抗原 (0ESCH2CH2C00H)与牛血清蛋白和卵清蛋白进行偶联，分别制得免疫原和包被原。
【发明内容】
[0008] 本发明需要解决的第一个技术问题在于提供一种肟基乙酸酯类杀菌剂的人工抗 原的合成方法及测定方法。
[0009] 1.技术方案
[0010] (1)人工半抗原合成
[0011] 在50mL三口瓶中，加入5mLlequiv的巯基丙酸乙醇溶液，然后加入2equiv的 NaOH，放在有加热功能的磁力搅拌器中搅拌反应，直至溶解。加入Iequiv的OEBr乙醇溶液， 加热回流反应I. 5h后抽滤得到透明溶液，旋转蒸发除去有机溶剂。然后用5mL5% NaHCO3 溶液溶解残留物并转移到分液漏斗中，用正已烷萃取2次，每次5mL，弃去有机相。然后用浓 盐酸调水相PH至3左右，和二氯甲烷进行液液分配，反复3次，收集有机相。有机相过无水 Na2SO4，减压浓缩近干，得黄色油状物。
[0012] ⑵人工抗原的合成
[0013] a.免疫原（活化酯法）：将半抗原0· Immol和NHSO. Immol用1.0 mLDMF溶解。磁 力搅拌下，向上述溶液中逐滴加入1.0 mL的0.1 mmol DCC的DMF溶液，室温搅拌反应lh，4°C 冰箱中搅拌过夜。次日，离心取上清液，在搅拌状态下，将上清液逐滴加入到6. OmL，60mg BSA的pH8. O硼酸缓冲液中，约半小时加完，室温磁力搅拌反应lh，4°C搅拌反应过夜，次日 取出，溶液转入透析袋中，悬于大烧杯中，4°C，pH7. 4的PBS缓冲液透析3天，每4h换水一 次。冻干保存。
[0014] b.包被原（混合酸酐法）：称取150mg OVA溶于IOmL的硼酸缓冲液中，80 μ mol 的半抗原溶解在ImL的DMF中，然后在该溶液中加入等当量的三正丁胺和氯甲酸异丁酯，室 温反应lh，反应液500 μ L加入到8mL的15mg/mL的OVA硼酸缓冲液中，磁力搅拌，反应2h。 反应完成后，转入透析袋，先用蒸馏水透析1次，再换PH7. 4的PBS透析，整个透析过程持续 三天，每4小时换透析液一次。冻干保存。
[0015] (3)本发明同时对所制备的人工半抗原及抗原的鉴定方法进行了公开说明，方法 包括TNBS显色法、红外光谱法、紫外光谱法、SDS-PAGE，具体包括下列步骤：
[0016] 1)人工半抗原的鉴定：称取合成的半抗原的样品，适当稀释成合适的检测浓度， 进行TLC(图3)、紫外（图4)、红外图谱扫描（图5)、质谱（图6)和核磁（图7)。读取半 抗原的波峰与波谷的位置并分析半抗原的官能团的红外吸收情况、分子量及各官能团的原 子组成。
[0017] 2)人工免疫原和包被原的鉴定：将BSA用蒸馏水配制成浓度为0、0.6、0.7、0.8、 0. 9、1.0 mg/mL的溶液，取ImL加入到ImL pHIO的碳酸盐缓比色。根据吸光值和蛋白质浓度 作出标准曲线。斜率即BSA单位浓度的吸光值。
[0018] 将制备的半抗原用蒸馈水配制成浓度为0、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9、L Omg/mL的溶液， 其余步骤同上，作出曲线，曲线斜率即为样品单位浓度的吸光值。
[0019] a.氣基消耗率=(0D蛋白单位浓度-OD样品单位浓度）/0D蛋白单位浓度
[0020] b. AR与载体蛋白克分子结合比=AR氨基消耗率X每分子载体蛋白氨基个数载体 蛋白的游离氨基大部分来自赖氨酸，每分子BSA和OVA赖氨酸个数以56和20计。
[0021] 同时，将制备的抗原进行紫外（图4)、红外（图8)、SDS-PAGE (图9)，须保证所含 的BSA的浓度在同一水平，分析结构与分子量。
[0022] 本方法合成的目的半抗原保留了肟基乙酸酯类杀菌剂毒杀基的化学结构，有利于 后续的免疫分析的特异性，合成过程简便，适合大量生产。
[0023] 本方法合成的目的人工免疫原和包被原符合免疫要求，操作易实现，可以商品化。
[0024] (4)在此基础上，本发明的第二项技术问题是用制备的免疫原免疫动物，得到针对 肟基乙酸酯类杀菌剂的多克隆抗体，对该抗体的进行鉴定并建立以醚菌酯和肟菌酯为代表 的肟基乙酸酯类杀菌剂的ELISA检测方法。
[0025] 制备高效价和高特异性的多克隆抗体首先要有理想的免疫原，合适的动物及可行 的免疫方法。目前，国内关于肟基乙酸酯类杀菌剂的免疫分析技术少见报道，尚无快速检测 方法的建立。本发明建立的肟基乙酸酯类杀菌剂ELISA检测技术，灵敏度和特异性较好，费 用低，仪器化要求低，前处理简便，有可观的经济效益。
[0026] 多克隆抗体制备的具体技术方案如下：
[0027] 1)实验动物：雄性新西兰大白兔，体重约2. 5kg ;
[0028] 2)免疫及采血：首免前7天，耳缘静脉取血，分离阴性血清。首次免疫，将免疫原 (2mg/mL)与等体积的FCA进行混合，充分乳化，形成油包水的状态，背部皮下6点，后腿肌 肉2点免疫；间隔两周，二次免疫，免疫原（lmg/mL)与等体积的FIA制备疫苗，背部皮下6 点，后腿肌肉2点免疫；从第三次免疫开始直到第七次，免疫原（lmg/mL)与等体积的FIA制 备疫苗，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫，以两周为间隔期，进行耳缘采血，分离血清，测效 价；末免，此时效价达到一定水平（3. 2 X IO4~6. 4X IO4)，将佐剂用生理盐水替代，耳缘静 脉注射,一周后,动脉取血,分离血清。
[0029] 酶联免疫检测效价的具体步骤为：
[0030] 1)包被原包板：将Hapten-OVA用包被液稀释至适当浓度，每孔100 μ L加入96孔 酶标板，盖上保鲜膜，37°C孵育2h ;
[0031] 2)清洗酶标板：迅速倒去孔中液体，用PBST洗涤2遍，每次洗3min ;
[0032] 3)封闭：每孔加入200 μ L封闭液，置于37°C恒温培养箱封闭2h ;接着用PBST洗 涤3遍后拍干；
[0033] 4)加入抗血清：按I : IO3~1 : 128 X IO3梯度稀释抗血清，加入酶标反应孔中， 每样至少重复一次，每孔加100 μ L，37°C孵育半小时，倒空，洗涤3遍，每遍3分钟，拍干。
[0034] 5)加二抗：将HRP酶标山羊抗兔IgG稀释1000倍，每孔加50 μ L37°C，30-60min， 倒净，洗板3次，每次3分钟，拍干；
[0035] 6)加入TMB显色剂显色：每孔100 μ L，置37°C避光放置10_15min。
[0036] 7)终止反应：每孔加入100 μ L终止液结束反应，应在20min内测定结果。
[0037] 8)酶标仪检测：TMB反应后酶标仪450nm波长读取OD45。。设空白及阴性对照，分别 为PBS溶液和免疫前采集的阴性兔血清。
[0038] (5)本发明的第三项技术问题是建立一种所述的肟基乙酸酯类杀