通过质谱法的c肽检测的制作方法
【专利说明】通过质谱法的C肽检测
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据美国法典第35卷第102条（e)款规定要求于2012年12月26日提交 的美国临时申请序列号61/745, 976的权益，其内容通过引用整体并入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及定量测量C肽。在具体方面，本发明涉及通过质谱法定量测量C肽的 方法。
[0004] 发明背景
[0005] 以下对本发明背景的描述被提供仅仅是作为帮助理解本发明，并不意在描述或构 成本发明的现有技术。
[0006] C肽是在从胰腺内胞吞小泡释放之前，作为胰岛素原（通过裂解）转化成胰岛素的 过程的部分而形成的肽。人C肽的摩尔质量约为3020. 3amu。
[0007] C肽与细胞表面的受体结合，并将引起刺激Na+、K+ATP酶和内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)的信号传导途径激活。这些酶在2型糖尿病中都具有降低的活性。C肽也起着修复 动脉肌层的作用。
[0008] C肽水平而非胰岛素通常在新诊断出患糖尿病的患者中测量，因为门静脉中的胰 岛素浓度会比外周循环高2至10倍的范围。肝脏从血浆中提取约一半的胰岛素，但这会随 着受试者的营养状况而变化。因此，C肽可以是比胰岛素直接测量更加全面的胰岛素状态 的指标。1型糖尿病患者无法有效产生胰岛素，因而将有下降的C肽水平，而2型糖尿病患 者的C肽水平通常是正常的或甚至升高的。因此，C肽测量用于将1型糖尿病与2型糖尿 病区分开。另外，当在天然胰岛素产生过程中形成C肽时，在经受胰岛素治疗的患者中测量 C肽可有助于确定患者正产生多少天然胰岛素。
[0009] C肽测量还可用于确定患者是否可能具有与多发性内分泌肿瘤综合征相关的胃泌 素瘤。存在胃泌素瘤的大量多发性内分泌肿瘤综合症还包括胰腺腺瘤、甲状旁腺腺瘤和垂 体腺瘤。更高水平的C肽与胃泌素瘤的存在一起提示，除了胃之外的器官可携带肿瘤。C肽 还可在疑似有胰岛素滥用的患者和患多囊卵巢综合征的妇女中进行评估，以评估胰岛素抗 性的程度。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明提供通过质谱法测定样品中C肽的存在或含量的方法。
[0012] 本文呈现的一些实施方式利用串联质谱法。在这些实施方式的一些中，方法包括： (a)将疑似含C肽的样品经历高效液相色谱法（HPLC)以得到C肽富集的部分；(b)将富集的 C肽在适合产生质谱法可检测的一种或多种C肽离子的条件下经历电离源；（c)通过串联质 谱法测定一种或多种C肽离子的量，其中所测定的离子包括具有质荷比为1007. 5±0. 5的 前体离子和选自具有由927. 6±0. 5、785. 4±0. 5和646. 1±0. 5组成的质荷比的离子组的 一种或多种碎片离子。在这些实施方式中，步骤（c)中所测定的一种或多种离子的量与样 品中C肽的量相关，例如，用于测定样品中C肽的量。在一些实施方式中，HPLC是I-D HPLC。 在一些实施方式中，选自927. 6±0. 5、785. 4±0. 5和646. 1 ±0. 5的两种或多种碎片尚子的 量在步骤（c)中被测定。
[0013] 在利用串联质谱法的其它实施方式中，方法包括：(a)将样品经历I-D高效液相色 谱法（1-D HPLC)以得到C肽富集的部分；(b)将C肽富集的部分在适合产生质谱法可检测 的一种或多种C肽离子的条件下经历电离源；和（c)通过串联质谱法测定一种或多种C肽 离子的量。在这些实施方式中，步骤（c)中所测定的离子的量与样品中C肽的量相关。在 一些实施方式中，步骤（c)中所测定的一种或多种离子包括质荷比（m/z)为约1007. 5±0. 5 的前体离子。在一些相关的实施方式中，步骤（c)中所测定的一种或多种离子进一步包括 选自具有质荷比（m/z)为约927. 6±0. 5、785. 4±0. 5和646. 1±0. 5的离子组的一种或多 种碎片离子。在一些相关的实施方式中，步骤（c)中所测定的一种或多种离子包括选自具 有质荷比（m/z)为约927. 6±0. 5、785. 4±0. 5和646. 1±0. 5的离子组的两种或多种碎片 离子。
[0014] 在利用串联质谱法的实施方式中，串联质谱法可通过任何本领域已知的方法进 行，包括例如多反应离子监测、前体离子扫描或产物离子扫描。
[0015] 在一些实施方式中，串联质谱法包括将具有质荷比为1007. 5±0. 50的前体离子 裂解成一种或多种碎片离子。在某些相关的实施方式中，一种或多种碎片离子包括选自具 有质荷比为 927. 6±0· 5、785· 4±0· 5、646· 1±0· 5、147· 0±0· 5 和 260. 3±0· 5 的离子的一 种或多种离子。在其它相关的实施方式中，一种或多种碎片离子包括选自具有质荷比为 927. 6 ±0. 5、785. 4±0. 5、646. 1 ±0. 5的尚子的一种或多种尚子。在两种或多种碎片尚子的 量被测定的实施方式中，所述量可经历本领域已知的任何数学处理以便使所测量的离子量 与样品中C肽的量相关。例如，两种或多种碎片离子的量可以作为测定样品中C肽量的部 分而被求和。
[0016] 本文呈现的一些实施方式利用高分辨率/高准确度质谱法。在这些实施方式中， 方法包括：(a)将疑似含C肽的样品经历高效液相色谱法（HPLC)以得到C肽富集的部分； (b)将C肽富集的部分在适合产生质谱法可检测的一种或多种C肽离子的条件下经历电离 源；和（c)通过高分辨率/高准确度质谱法测定一种或多种C肽离子的量。在这些实施方 式中，步骤（c)中所测定的离子的量与样品中C肽的量相关。
[0017] 在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法是在分辨率或FWHM (极大值半处 的全宽度）为10, 〇〇〇和质量准确度为50ppm下进行的。在一些实施方式中，高分辨率/高 准确度质谱仪是高分辨率/高准确度飞行时间（TOF)质谱仪。在一些实施方式中，HPLC是 I-D HPLC。在一些实施方式中，步骤（c)中所测定的一种或多种离子包括具有电荷为2+或 3+的离子。在一些实施方式中，步骤（c)中所测定的一种或多种离子包括选自具有质荷比 (m/z)在约1007. 5±1和1510. 3±1范围内的离子组的离子。
[0018] 在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法在大于或等于约10, 000的分辨率 (FWHM)进行，如大于或等于约15, 000,如大于或等于约20, 000,如大于或等于约25, 000。 在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法在小于或等于约50ppm的准确度下进行，如 小于或等于约20ppm，如小于或等于约lOppm，如小于或等于约5ppm ;如小于或等于约3ppm。 在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法在大于或等于约10, 〇〇〇的分辨率（FWHM) 和小于或等于约50ppm的准确度下进行。在一些实施方式中，分辨率大于约15, 000并且准 确度小于或等于约20ppm。在一些实施方式中，分辨率大于或等于约20, OOO并且准确度小 于或等于约IOppm ;优选地分辨率大于或等于约20, 000并且准确度小于或等于约5ppm，如 小于或等于约3ppm。
[0019] 在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法可以用轨道阱质谱仪、飞行时间 (TOF)质谱仪或傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（有时称作傅里叶变换质谱仪）进行。
[0020] 在本文所描述的任何方法中，样品可包括生物学样品。在一些实施方式中，生物学 样品可包括体液，如尿液、血浆或血清。在一些实施方式中，生物学样品可包括来自人的样 品；如来自成年男性或女性，或未成年男性或女性，其中未成年人是年龄在18岁以下、15岁 以下、12岁以下或10岁以下。人样品可被分析以诊断或监测疾病状态或状况，或监测疾病 状态或状况治疗的疗效。在一些相关的实施方式中，本文所描述的方法可用于测定当从人 获取时的生物学样品中C肽的量。
[0021] 在利用串联质谱法或高分辨率/高准确度质谱法的实施方式中，样品可在电离之 前经历高效液相色谱法（HPLC)。
[0022] 在利用串联质谱法或高分辨率/高准确度质谱法的实施方式中，样品在经历分析 柱如高效液相色谱（HPLC)柱之前可经历萃取柱，如固相萃取（SPE)柱。在一些相关的实施 方式中，萃取柱不是免疫纯化柱（即，免疫亲和柱）。在一些实施方式中，在方法中的任何点 都不使用免疫纯化。在可选实施方式中，用免疫纯化技术从样品中萃取C肽；如用免疫亲和 萃取柱。
[0023] 在利用萃取柱如固相萃取柱（SPE)、分析柱如高效液相色谱（HPLC)柱和电离源中 的两种或多种的实施方式中，可以以线上方式连接这些组件中的两种或多种，以允许自动 样品处理和分析。
[0024] 本文呈现的任何方法中，样品可包括生物学样品；如体液样品，包括例如血浆或血 清。
[0025] 质谱法（串联质谱法或高分辨率/高精度质谱法）可以阳离子模式进行。可选地， 质谱法可以阴离子模式进行。各种电离源，包括例如大气压化学电离（APCI)或电喷雾电离 (ESI)可用于电离C肽。在一些实施方式中，C肽以阳离子模式通过ESI电离。
[0026] 在本文呈现的任何方法中，单独可检测的内部标准品可提供在样品中，其在样品 中的量也被测定。在利用单独可检测的内部标准品的实施方式中，存在于样品中的感兴趣 的分析物和内部标准品两者的全部或部分被电离以产生多个质谱仪可检测的离子，并通过 质谱法检测从每个产生的一种或多种离子。在这些实施方式中，从感兴趣的分析物所产生 的离子的存在或量通过与所检测的内部标准品离子的量比较可与样品中感兴趣的分析物 的量相关。
[0027] 可选地，样品中C肽的量可通过与一种或多种外部参考标准品进行比较而被测 定。示例性外部参考标准品包括掺入有c肽或其同位素标记的变体的空白血楽:或血清。
[0028] 在一些实施方式中，所述方法证明对C肽水平测定的线性范围至少在约 0· 049ng/50 μ L 至 25ng/50 μ L 的范围内。
[0029] 如本文所使用的，除另外指出，单数形式"一个（a，an，或仅该冠词所修饰的名 词）"和"所述（该，the)"包括复数指示物。因此，例如，提及"蛋白质（a protein)"包括 多个蛋白质分子。
[0030] 术语"纯化"（"purification"或"purifying"）和"富集"并不是指从样品中除 去感兴趣的分析物（一种或多种）以外的所有物质。相反，这些术语指的是相对于样品中 可能干扰感兴趣的分析物测定的其它组分富集一种或多种感兴趣的分析物的量的程序。通 过多种手段纯化样品可使一种或多种干扰物质，例如可能干扰或可能不干扰通过质谱法检 测所选母离子或子离子的一种或多种物质，相对