通过单分子操作来检测dna修饰和蛋白结合的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于确定蛋白是否结合特异性DNA序列的方法。这种方法特别用于通 过特异性识别这些修饰的蛋白（例如，抗体）的结合来鉴定DNA序列的修饰（例如，甲基 化），也用于鉴定各种蛋白在DNA上的结合序列。
【背景技术】
[0002] 蛋白与DNA的结合是在生物学中的重要现象；它在调节细胞和病毒功能中具有基 本作用。这些包括基本细胞过程，如DNA复制、转录、DNA修复和DNA重组、还有DNA修饰或 染色体结构的维护。
[0003] 有几种蛋白结合到基因组中特定位点来调苄基因组的表达和维持。DNA-结合蛋白 组成具有多样化和重要生物学功能的蛋白大家族。DNA-结合蛋白家族是细菌、古生菌和真 核生物的各种基因组中最受关注和研究最多的之一。大多数这些蛋白（如真核和原核转录 因子）含有独立的折叠单元（结构域）以实现其与DNA轮廓的识别。它们包括重要的基因 调节蛋白（称为转录因子及DNA加工蛋白），如例如DNA和RNA聚合酶、DNA连接酶、DNA解 旋酶、DNA内切酶和外切酶、以及DNA修复和重组蛋白。
[0004] 已证明鉴定这些蛋白结合位点是艰巨的任务。例如，在人类基因组中，有多于700 个预测的C2H2锌指转录因子（Tacbpally等人，BMC Evol. BioL，8:176, 2008)，但这些中只 有约 10%具有已知结合基序（Matys 等人，Nucleic Acids Res.，34:D108-D110, 2006)。此 外，虽然蛋白结合DNA的热力学平衡性质是公知的，然而测定其结合和解结合的动力学是 更具挑战性的问题。
[0005] 使用各种方法，如凝胶移位分析、足迹、和转录激活来研究DNA-蛋白相互作用 (Carey 等人，Cold Spring Harb Protoc, 2012 (7) :733-57, 2012)。虽然每种这些方法可提 供关于结合的位置或影响的不同信息，它们却不能提供定量测量特异性结合的简单方法。 荧光偏振/各向异性提供了快速、非放射性方法以直接在溶液中不使用过滤器结合、电泳、 或沉淀步骤就能精确测量DNA-蛋白结合（Guest等人，1991 ;Heyduk和Lee, 1990 ;LeTilly 和 Royer, 1993 ;Lundblad 等人，1996 ;Royer 等人，1992)。
[0006] 基因组信息指导不同生物分子合成的分子机制一直是过去三十年很多分子生物 学研究的重点。以前的研究通常集中在单个基因，使用所得到的一般原理然后为以下提供 见解：转录、染色质重塑、信使RNA剪接、DNA复制和许多其它基因组加工。尽管在研究其它 基因时很多这样原理似乎有效，然而这些原理通常没有提供关于基因组范围对生物功能的 见解。另一方面，转录和调节信息的系统分析对鉴定基因和调节区是必需的，并且是人类生 物学和疾病研究中的重要的资源。这种分析还可以提供对细胞环境、物种和个体中组织和 基因变异性（variability)以及调节信息的综合观点。
[0007] 全基因组的努力，例如编码项目（Encode pro ject) (DNA元件的百科全书 (Encyclopedia of DNA Elements))，来鉴定例如在人类基因组中的所有转录因子结合位 点，这已被证明很麻烦并且是非常劳动密集型的（The ENCODE Project Consortium, Natu re, 489:57-74, 2012)〇
[0008] 因此，仍然需要检测蛋白/核酸相互作用的简单而可靠的方法。
【发明内容】
[0009] 本发明涉及通过物理操作用于确定蛋白与核酸分子结合的方法。
[0010] 根据本发明的基于物理技术和电子处理的方法，不同于目前化学或生物化学的方 法。其比现有技术提供很多优点：
[0011] 1)其是高度灵敏的，因为它是基于检测单蛋白或蛋白复合物分子与单核酸分子。 使用单分子不仅能够提供测量蛋白寻找其核酸靶所需时间以及蛋白停留在其靶上时间，还 能够精确定位结合事件。
[0012] 2)不使用昂贵的（具有荧光团或一些其它基团）标记的核苷酸。
[0013] 3)通过测量双链核酸分子两端之间的距离，使得它能够确定蛋白结合位点沿着所 述双链核酸上的精确定位（以bp计）。
[0014] 4)可在第二时标（time-scale)中周期性重复测量，从而导致消除假阳性、改进统 计并显著降低仪器漂移（drift)。
[0015] 5)实验可以在同一分子上重复多次，从而改进统计和测量的可靠性。
[0016] 6)它能够检测任何核酸结合蛋白。因此，可鉴定特异性识别核酸的结构修饰的蛋 白，从而检测结构修饰的位点。
[0017] 本发明涉及基于蛋白在测序的核酸分子上的结合位点的物理定位来检测蛋白与 核酸序列的结合的方法。
[0018] 在本发明的上下文中，"结合"是指大分子之间（例如，蛋白和核酸之间）的非共价 相互作用。这样相互作用一般以10 6M1或更低的解离常数（Kd)来表征。"亲和性"是指结 合的强度：增加结合亲和性与更低的Kd相关。
[0019] "检测蛋白与核酸分子的结合"本文指，导致直接或间接获得关于存在或不存在所 述蛋白和所述核酸分子之间相互作用的某些信息的所有活动。检测所述结合可涉及或可不 涉及确定其它信息，如例如结合反应的动力学参数或蛋白结合位点的序列。本领域技术人 员将明白，本发明的方法允许容易地进行这样的确定。
[0020] 本发明基于这样的观察，即变性双链核酸的两条链在适当的条件下将重新杂交。 如果在复性步骤期间分子结合所述变性双链核酸分子的任意链，重新杂交仅仅是部分的。 本发明人现在已发现，在特定条件下重新杂交中的这种永久或短暂的暂停可用于检测蛋白 与所述变性双链核酸分子之间的相互作用。根据本发明，有可能检测双链核酸分子重新杂 交的阻断；与这种阻断相关的物理参数（如，阻断持续时间，阻断在双链核酸分子上的位 置）然后允许检测蛋白与核酸序列之间的相互作用。
[0021] 因此，本发明涉及用于确定蛋白与核酸分子结合的方法，所述方法包括检测变性 的双链核酸分子的复性阻断的步骤。
[0022] "变性"在此处表示双链之间的大部分氢键断裂时发生的所述双链核酸分子的两 条链分离的过程。变性过程产生变性的核酸分子，其在此处表不双链核酸分子变性所产生 的两条分离的互补链。"复性"在此处指这样的过程，通过这种过程两条分离的互补链通过 杂交重新形成双螺旋。如此处所用，"杂交"是核酸的两条或更多互补链之间建立非共价的、 序列特异性的相互作用从而形成单个杂交体的过程。
[0023] 本领域技术人员已知用来变性核酸的几种可能。在最优选的方式中，通过向两条 链施加物理力将它们分开。根据本发明的"物理力"是导致物体经历某种改变，或者关于其 运动、方向或几何构造的任何影响。本领域技术人员将清楚根据本发明的力与其它物理参 数，如温度（这是直接的物质属性而不是施加于其上的影响）不同。根据本发明的物理力 包括这样的力，如摩擦力、拉力、法向力（normal force)、空气阻力、作用力、和弹力。最优选 地，根据本发明的物理力是拉力。根据本实施方式，所述双链核酸的游离端可被拉开，因此 使配对碱基之间的所有键断裂，从而打开双链核酸。
[0024] 本发明适用于任何类型的双链核酸。大多数情况下，双链核酸将是DNA，但应当理 解，本发明也适用于完全配对的或者不完全配对的单链DNA-单链DNA双链体，或适用于完 全配对的或者不完全配对的单链DNA-单链RNA双链体，或适用于完全配对的或者不完全配 对的单链RNA-单链RNA双链体。此外，双链体可由获自不同来源的样本的两条单链的至少 部分重新配对组成。最后，本发明也适用于唯一单链DNA或唯一单链RNA的二级结构。
[0025] 因此，本发明的方法涉及用于检测蛋白与核酸分子结合的方法，所述方法包括以 下步骤：
[0026] ?通过向双链核酸分子施加物理力使所述分子变性；以及
[0027] ?检测双链核酸复性的阻断。
[0028] 有利地，所述方法包括确定阻断位置的另一步骤。
[0029] 在这种类型用于分析蛋白与DNA分子结合的方法中，为了促进重新配对，有利的 是在被拉开之前安排双链DNA分子的游离端（即没有附着至支持物的端）共价或准共价连 接至另一端。在优选的实施方式中，双链核酸分子是发夹。如果想要双链核酸示意性表示 在本发明的上下文中，可以将其比作"拉链"（zip fastener)，其被打开（或关闭）：双链核 酸的变性就是拉开拉链，复性是重新拉上拉链。
[0030] 本发明人已经观察到，在一定条件下，当分子结合变性双链核酸分子时，所述双链 核酸分子的复性被阻断。结合的分子可以是对所述变性双链核酸分子上的特异性序列具有 亲和性的任何类型的分子，如核酸、蛋白质或小分子。
[0031] 在本发明的第一方面，蛋白用于阻断所述双链核酸的复性。
[0032] 如本文所用的术语"蛋白"、"蛋白质"和"多肽"是同义词并且是指通过肽键共价 连接成链的氨基酸聚合物。在一个氨基酸的羧基基团的和下一个氨基酸的氨基基团之间形 成肽键。术语还适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或更多个氨基酸是相应的天然存在 氨基酸的化学类似物或修饰的衍生物。术语"氨基酸"指所有处于其D和L立体异构体形 式的天然存在的α氨基酸，以及其类似物和衍生物。类似物被定义为在氨基酸中的原子被 通常具有类似性质的不同原子所取代。衍生物被定义为具有附着至其上的其它分子或原子 的氨基酸。衍生物包括，例如，氨基的乙酰化、羧基的氨基化、或两个半胱氨酸分子的硫残基 氧化以形成胱氨酸。
[0033] 蛋白可以具有多种功能。"结合蛋白"是能够非共价结合到另一个分子的蛋白。结 合蛋白可以结合，例如，DNA分子（DNA结合蛋白）、RNA分子（RNA结合蛋白）和/或蛋白分 子（蛋白-结合蛋白）。在蛋白结合蛋白的情况下，其可以自己结合（以形成多聚体）和/ 或其可以结合到不同的蛋白或蛋白的一种或更多种分子。结合蛋白可以具有多于一种类型 的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白结合活性。因此，根据本发明 的"核酸结合蛋白"是能够与核酸相互作用的蛋白。因而，根据本发明的"单链核酸结合蛋 白"是能够与单链核酸相互作用的蛋白，而根据本发明的"双链核酸结合蛋白"因此是能够 与双链核酸相互作用的蛋白。
[0034] 根据本实施方式，本发明的方法因此涉及用于确定蛋白结合含有核酸序列的核酸 分子的方法，所述方法包括以下步骤：
[0035] a)通过向含有所述序列的双链核酸分子施加物理力，使所述分子变性；
[0036] b)提供所述蛋白；
[0037] c)在所述蛋白存在时，使所述双链核酸分子复性；以及
[0038] d)检测双链核酸分子复性的阻断。
[0039] 有利地，所述方法包括确定阻断位置的另一步骤。
[0040] 在本领域中公知，基于核酸结合蛋白能否结合单链核酸（ssDNA和ssRNA)或者核 酸结合蛋白能否结合双链核酸（dsDNA、dsRNA、DNA/RNA杂交体等），区分核酸结合蛋白。
[0041] 在本发明方法的第一实施方式中，用来阻断变性的双链核酸复性的蛋白是能够结 合单链核酸的蛋白。
[0042] 对单链核酸具有亲和性的核酸结合蛋白将能与变性双链分子本身相互作用，从而 导致阻断双链核酸的复性。技术人员将意识到，即使蛋白不结合到特异性的序列，本发明 也能够容易和精确地确定结合反应动力学的参数。事实上，单链核酸结合蛋白通常对特异 性序列最不具有亲和性，而是通常对核酸具有亲和性。例如，已知解旋酶结合ssDNA缺口 (gap)以解旋dsDNA。细菌单链DNA结合蛋白、或SSB结合到DNA的单链区以阻止提前退 火，防止单链DNA被核酸酶消化以及从DNA中去除二级结构。Rad52蛋白，是一种对DNA双 链断裂修复和同源重组重要的蛋白，其结合单链DNA末端，并介导互补DNA链退火所必须的 DNA-DNA相互作用。
[0043] 这些单链核酸结合蛋白具有对核酸的广泛亲和性，这意味着在本发明上下文中， 无论核酸序列如何，所述蛋白都能够结合所述单链核酸。这种非序列特异性核酸结合蛋白 以低于100倍、通常低于10倍变化的解离常数结合多个不相关DNA序列的不同序列。
[0044] 在另一方面，一些核酸结合蛋白对含有特异性序列的核酸分子具有亲和性，即其 仅识别和结合含有所述序列的核酸。并不是结合相互作用的所有组份都需要是序列特异性 的（例如，与DNA骨架上的磷酸残基接触），只要这种相互作用作为整体是序列特异性的。 事实上，虽然大量单链核酸结合蛋白仅具有广泛的核酸亲和性，这些蛋白中的一些能够在 特异性序列上结合单链核酸。因此，序列特异性核酸结合蛋白，以比不相关的序列高至少 100倍的亲和性