多层荧光纳米颗粒及其制备和使用方法
【专利说明】多层荧光纳米颗粒及其制备和使用方法
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2013年2月20日提交的美国临时专利申请号61/767, 066的优先权， 其公开的内容通过引用并入本申请。
[0003] 关于联邦政府咨助研究的声明
[0004] 本发明在由美国国土安全部提供的合同号为2009-ST-108-LR0004的政府支持下 进行。政府享有本发明的一些权益。 发明领域
[0005] 本公开通常地涉及分层的含荧光响应材料的纳米颗粒。更特别地，本公开涉及多 层的含荧光响应材料的二氧化硅纳米颗粒。
【背景技术】
[0006] 药物发现、药物筛选、基因表达和作为疫苗靶点的蛋白鉴定基于进行涉及大量分 子的高通量筛选（HTS)测定。这需要筛选针对特定靶分子（如蛋白、抗体、核苷酸或肽）的 较大的化合物库。筛选较大的库或生物多重测定（biological multiplexing)加速了用于 治疗和诊断应用的工具的开发。生物多重测定涉及同时进行多项测定，而不损失敏感性和 特异性。推行小型化的HTS导致每天筛选数以千计的化合物。从上到下的二维阵列制造技 术导致了 DNA芯片、微阵列和bioMEMS的发展。基于模式识别的位置编码进一步有助于鉴 定特定的分子指纹。这些技术的一些主要缺点是它们就设备设置和试剂而言是昂贵的，且 就样品制备和阵列制造而言是复杂的。而且，由于交叉反应性和重现性所导致的测量的变 化性使得这些方法难以用于大规模分析。
[0007] 此前已对使用基于颜色分配的珠粒技术进行多重编码的可能性进行了探索。使用 两种有机染料在用于多重测定的8种不同的强度水平下对5. 5 μπι聚苯乙烯珠粒编码。通 过在适宜溶剂混合物中溶胀聚合物，合成了在6种不同的强度水平下以不同比例使用6种 光谱可区分的CdSe/ZnS核-壳量子点纳米颗粒编码的1. 2 μ m聚苯乙稀珠粒。在上述情况 中的荧光物质均被物理地掺入微米尺寸的聚苯乙烯颗粒，并且由于其具有较大的尺寸，因 而无法容易地用于体内多重或细胞内生物成像。基于可用反应位点的数量，通过使用不同 比例的两种有机荧光团精确地标记DL-DNA，开发了基于树枝状大分子样DNA (DL-DNA)的荧 光纳米条码。为了增强来自这些纳米条码的荧光信号，再次使用微珠作为成像和分子检测 的载体。类似地，合成以不同染料比例将染料编码的70nm的基于荧光共振能量转移（FRET) 的二氧化硅纳米颗粒，并将其负载于10 μm的链霉亲和素涂覆的微球上。通过开发以不同 染料比例将染料编码的>l〇〇nm的基于（FRET)的二氧化硅颗粒（随后将所述二氧化硅颗粒 负载于作为多重测定底物的10 μπι聚苯乙烯微球上），将这项工作推广并应用于在组合化 学中的光学编码。基于加入反应混合物中的染料并假定掺入所有的染料，从而量化在这些 基于FRET的颗粒中编码的染料比例。由于最终珠粒的较大的尺寸（>1 μπι)，这些情况均未 显示出细胞内成像。
[0008] 因而，需要制备多重编码的颗粒，其中FRET被抑制以获得所需水平的颗粒亮度， 并且因此获得所需的信噪比，所述颗粒的尺寸为约IOOnm或更小，并且由于尺寸低于IOOnm 的颗粒特别适用于细胞摄取，因此所述颗粒能够用于体内和体外应用，并且因此是细胞内 成像应用所需的。
[0009] 发明概沐
[0010] 本文公开了具有任选的表面PEG涂层（用于使用不同的部分（如蛋白、核酸、小 分子）官能化）的多色荧光二氧化硅纳米颗粒（在本文中也称为多层的含荧光响应材料 (FRM)的纳米颗粒、mcC点和三色C点以及多色C点）。可以将多色荧光二氧化硅纳米颗粒 称为亮多色荧光二氧化硅纳米颗粒。例如，含有在两个、三个或更多个不同强度水平下的两 种、三种或更多种光谱不同的染料的纳米颗粒具有低于IOOnm的尺寸。所述多色荧光二氧 化硅纳米颗粒可以用于例如细胞内生物成像、高通量筛选和医学诊断。
[0011] 在一个实施方式中，所述二氧化硅纳米颗粒含有染料N- (7-二甲基氨基-4-甲基 香豆素-3-基）马来酰亚胺（DACm(蓝色））、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺（TMRm(绿色）） 和Cy5-马来酰亚胺（Cy5m(红色））。这些染料以每种染料三个强度水平（无染料、低染料 或高染料）而被包含。对颗粒构造进行设计，以控制每种颜色的染料数量，并且使得染料之 间的能量转移最小化以获得最大亮度。三种染料在三个强度水平的这种组合使得基于波长 和荧光强度合成了 26种可区分的颗粒。与游离染料相比，所述纳米颗粒具有1至3个数量 级的荧光亮度增强。具有高染料负载的纳米颗粒的亮度是具有中等染料负载的颗粒的~ 3. 5-4倍。在该体系中，通过掺入额外的二氧化硅壳由中等染料负载移至高染料负载不会减 少所述纳米颗粒的相对荧光发射。
[0012] 进行制备多色荧光二氧化硅纳米颗粒的方法，使得例如染料以逐层的方式加入掺 杂染料的颗粒的核，并且每种光谱不同的染料由纯的二氧化硅壳空间分隔，以降低染料之 间的能量转移。
[0013] 在一个实施方式中，合成所述纳米颗粒，使得三种染料以逐层的方式加入，其中绿 色在核中，然后是在内壳中的红色，然后蓝色作为最后的染料层加入。但是，在不影响所述 纳米颗粒性能的情况下，可以进行任意顺序的染料加入。染料层由足够厚的二氧化硅壳空 间分隔，以有效抑制染料层之间的能量转移。因此，每个单独的颗粒均具有洋葱型结构，所 述洋葱型结构具有例如在染料核周围的多达24个不同的层。
[0014] 附图简沐
[0015] 图I : (a)将三种染料TMRm (绿色）、Cy5m(红色）和DACm (蓝色）掺入二氧化硅 纳米颗粒（中心）的逐层方法以及基于每种染料的包封水平（分别为〇、5、20个染料）的 可能组合的示意图。简言之，具有中等染料负载（~5个染料/颗粒，浅色）和高染料负载 (~20个染料/颗粒，深色）的颗粒以浅色/深色的绿色、红色和蓝色显示。（b)拍摄的在 水中的26个合成的核-壳多色荧光纳米颗粒的照片，所述26个合成的核-壳多色荧光纳 米颗粒以不同的行排列为无TMRm的颗粒（无绿色，下面一行）、具有~5TMRm的颗粒（较低 的绿色染料负载，中间一行）和在核中的具有~20TMRm染料的颗粒（高的绿色染料负载， 上面一行）。注意最下面一行（左侧）的第27个比色皿显示了无任何染料（即具有颜色组 合〇,〇,〇)的纯二氧化硅颗粒的溶液。（c)图Ib中显示的纳米颗粒的要点。空白表示作为 对照的无任何染料的纯二氧化硅颗粒。TMRm(绿色）、Cy5m(红色）和DACm(蓝色）。
[0016] 图2 :多色C点（mcC点）合成的示意图：(a)对具有不同的每个颗粒的平均染料 数的合成批次的泊松分布之间的重叠进行比较的图，参见图例。曲线的顺序从左至右为：5、 10、15、20个染料/颗粒。（b)三种染料TMRm(I)、Cy5m (2)和DACm (3)的马来酰亚胺衍生物 与（3-巯基丙基）-三甲氧基硅烷反应以获得分别的染料-硅烷缀合物的通用反应示意图。 (c-e)单色C点的逐层染料添加：TMRm颗粒（G)、Cy5m颗粒（R)和DACm颗粒（B)，随后加入 5k摩尔质量的聚乙二醇硅烷（PEG-硅烷）作为最后的层；（f-h)由G和R单色C点起始的 具有不同亮度水平的双色mcC点（(f)为G和R组合、（g)为G和B组合，且（h)为R和B 组合）的逐层方法，随后使用PEG-硅烷封端；和（i)由含有双色C点的G和R起始的使用 PEG-硅烷封端的三色C点的逐层方法。
[0017] 图3 :单色C点的表征。图（a-c)对中等和高染料负载的纳米颗粒与（a)TMRm、（b) Cy5m和（c)DACm的母体游离染料的吸光度和荧光光谱进行比较。游离染料的溶液和颗粒 的溶液在这些测量之前是吸光度匹配的。图（d-f)对在溶液中的游离染料（实线）的FCS 自相关曲线与中等（空心圈）和高（实心圈）染料负载的纳米颗粒：(d)TMRm、（e)Cy5m和 (f)DACm的FCS自相关曲线进行比较。图（g-i)对（g)TMRm体系、（h)Cy5m体系和（i)DACm 体系的如由FCS检测器数据集测得的每种荧光物质的亮度（染料vs颗粒）进行比较。
[0018] 图4 :mcC点的表征。（a)在溶液中的获得三色C点的特定颗粒中间体的代表性FCS 曲线，其覆盖了从中等/高TMRm染料负载的单色C点（mG，绿色空心圈/hG，绿色实心圈） 起始，经由中等/高Cy5m染料负载的双色C点（hGmR，红色空心圈/hGhR，红色实心圈），至 具有中等/高DACm染料负载的最终三色C点（hGhRmB，蓝色空心圈/hGhRhB，蓝色实心圈） 的整个合成路线。蓝色（左侧曲线）、绿色（中间曲线）、红色（右侧曲线）。（b)由蓝色 (左）、绿色（中）和红色（右）激发获得的三色C点的代表性荧光发射光谱。（c)由稳态 荧光发射光谱测定的26个荧光二氧化硅纳米颗粒中的每一个的实验强度性质的总结。绿 色柱表示来自TMRm的发射、红色柱表示来自Cy5m的发射，蓝色柱表示来自DACm的发射。柱 的高度表示发射强度水平。
[0019] 图5 :显示通道的在RBL-2H3肥大细胞中的mcC点的共聚焦荧光显微图像，（a)绿 色 Ch :560nm，（b)红色 Ch :633nm，（c)蓝色 Ch :405nm，（d)黄色 Ch :488nm ; (e) (a、b、c 和 d)的重叠图像，（f)亮场图像。
[0020] 图6 :显示含有至多17种不同颗粒的细胞的单一 512x 512混合颗粒图像图块。 (a-d)图像在红色、绿色、蓝色和黄色通道同时采集。（e)叠加全部四个荧光图像以显示颗 粒实际上在细胞内。（f)在亮场采集的图像。
[0021] 图7 :将17种光谱不同的多色纳米颗粒装载进入大鼠嗜碱性白血病细胞中。（a) 显示多颗粒样品成功"解码"的细胞的全尺寸（1280x 1280像素）假彩色图像，所述细胞各 自负载17种单"色"me C点中的1种。说明颗粒组成和所指定的细胞颜色的颜色-编码图 例在右下角显示。（b)相同图像的放大区。
[0022] 发明详沐
[0023] 本公开提供了多层的含荧光响应材料（FRM)的纳米颗粒。还提供了制备和使用所 述多层的含FRM的纳米颗粒的方法。
[0024] 本公开的多层的含FRM的纳米颗粒提供了能够通过特定的FRM及FRM水平而唯一 识别的纳米颗粒。具有用于识别的内置码的纳米颗粒能够作为分子运载体和标签。特定的 FHM/水平组合（可以将其描述为光学"条码"）能够通过其荧光发射（例如以图像的形式） 识别。例如，在具有不同FHM/水平组合的多层的含FRM的纳米颗粒的混合物中，每个不同 的FHM/水平组合能够得以唯一识别。每个可区分的颗粒类似于2-D阵列技术中的单一孔 或阵列。因此多重测定不受孔或阵列数量的限制，但是受可区分的颗粒的数量的限制。纳 米颗粒的构造使层内和层间FRM的荧光淬灭最小化。这通过有效使用颗粒中的所有荧光染 料而提供了具有所需的亮度的纳米颗粒，从而在光学/荧光检测方案中产生所需的信躁比 水平。
[0025] 在一个方面，本公开提供了多层的含FRM的二氧化硅纳米颗粒。所述纳米颗粒包 含能够以一种或多种量（即水平）存在的一种或多种荧光响应材料（FRM)。所述纳米颗粒 的尺寸（例如直径）可以是5nm至500nm，包括其间所有的整数值和范围。
[0026] 本文提及多层的含FRM的纳米颗粒旨在包括多层的含染料的纳米颗粒。本申请中 提及的无FRM的二氧化硅层旨在包括无染料的二氧化硅层。本文提及含FRM的二氧化硅层 旨在包括含有染料的二氧化硅层。本文提及最外的无FRM的二氧化硅层旨在包括最外的含 染料的二氧化硅层。本文提及FRM旨在包括染料分子。本文提及FRM-缀合物前体旨在包 括染料-缀合物前体。本文提及最外的含FRM的二氧化硅层旨在包括最外的含染料的二氧 化娃层。
[0027] 在一个实施方式中，所述纳米颗粒包含二氧化硅核、1至100个含FRM的二氧化硅 层、一个或多个无FRM的二氧化娃层、设置于最外的含FRM的二氧化娃层上的最外的无FRM 的二氧化硅层，和与所述最外的无FRM的二氧化硅层的外表面共价结合的多个聚（乙二醇） 分子；所述二氧化硅核含有与所述核的二氧化硅网络共价结合的多个FRM分子，每个含FRM 的二氧化硅层均包含与所述含FRM的二氧化硅层的二氧化硅网络共价结合的多个FRM分 子，所述无FRM的二氧化硅层之一将所述二氧化硅核与所述含FRM的二氧化硅层之一分隔， 并且，如果存在，所述含FRM的二氧化硅层的每个相邻对被所述无FRM的二氧化硅层之一所 分隔。所述纳米颗粒还可以包含与共价结合至所述最外的无FRM的二氧化硅层的外表面的 所述聚（乙二醇）分子共价结合的一个或多个部分（例如蛋白、肽、核酸、适体、抗体、抗体 片段、聚合物、有机小分子及其组合）。所述纳米颗粒能够具有的直径为5nm至500nm，包括 其间所有的整数nm值和范围。每个无FRM的二氧化娃层的厚度（例如Inm至20nm)使得 在所述核中的FRM与在一个相邻的含FRM的二氧化硅层或多个相邻的含FRM的二氧化硅层 中的FRM之间具有低于10 %的可检测的能量转移。
[0028] 在另一个实施方式中，所述纳米颗粒包含二氧化硅核、1至100个含FRM的二氧化 娃层、一个或多个无FRM的二氧化娃层，和设置于最外的含FRM的二氧化娃层上的最外的无 FRM的二氧化硅层；所述二氧化硅核含有与所述核的二氧化硅网络共价结合的多个FRM分 子，每个所述含FRM的二氧化硅层均包含与所述含FRM的二氧化硅层的二氧化硅网络共价 结合的多个FRM分子，所述无FRM的二氧化硅层之一将所述二氧化硅核与所述含FRM的二 氧化硅层之一分隔，并且，如果存在，所述含FRM的二氧化硅层的每个相邻对被所述无FRM 的二氧化硅层之一所分隔。所述纳米颗粒能够具有的直径为5nm至500nm，包括其间所有的 整数nm值和范围。每个无FRM的二氧化娃层的厚度（例如Inm至20nm)使得在所述核中 的FRM与在一个相邻的含FRM的二氧化硅层或多个相邻的含FRM的二氧化硅层中的FRM之 间具有低于10%的可检测的能量转移。
[0029] 在一个实施方式中，每个无FRM的二氧化硅层可以设置于二氧化硅核或含FRM的 二氧化硅层上。
[0030] 在另一个实施方式中，所述纳米颗粒包含a)二氧化硅核，所述二氧化硅核含有与 所述核的二氧化硅网络共价结合的多个FRM ;和b)围绕所述二氧化硅核的无FRM的二氧化 硅层与含FRM的层的交替的层。最外层是无FRM的二氧化硅层或含FRM的层。任选地，多 个聚醚分子共价结合最外的无FRM的二氧化硅层或含FRM的层的外表面。
[0031] 所述核的形状基本上是球形，并且其尺寸（例如直径）可以为Inm至20nm，包括其 间的所有整数nm值。所述核具有能够与所述核的氧化硅网络共价结合的多个荧光响应材 料（例如焚光响应分子，如染料分子和颜料分子）。
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