一种库尔勒香梨花丝细胞立体染色方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物细胞技术领域，具体涉及一种关于库尔勒香梨花丝细胞立体染色的技术领域。
【背景技术】
[0002]库尔勒香梨是蔷薇科梨亚科梨属新疆梨的一种，是新疆巴州地区和阿克苏地区的主栽果树品种，因香味浓郁、皮薄肉脆、清甜可口、细嫩多汁、营养丰富而闻名于世，已成为新疆重要的出口创汇果品之一。新疆林果办2011年数据显示，新疆库尔勒香梨栽培面积已达5.10万hm2，挂果面积约3.64万hm2，年产量约70万吨，销售以国内市场为主，产值约20亿元。库尔勒香梨有“果中王子”之称，具有保护心脏，减轻疲劳，增强心肌活力，降血压等多重功效，尤其能祛痰止咳，消热解暑，滋阴润肺，深受消费者青睐。库尔勒香梨果皮表面蜡质厚，成熟后微带红晕，肉白酥脆，多汁且果香浓郁，耐贮藏，甜度高，皮薄汁多，果点和锈斑少且小，肉质细脆，无公害或绿色产品逐年增多，是库尔勒香梨国内外市场的竞争优势。
[0003]研究发现，近几年香梨种植者为了追求高产，在管理过程中授粉树种搭配不合理，人工授粉时选用花粉种类不当，往往导致库尔勒香梨果实大小不一，果形不规则，粗皮现象严重，果皮着色不均匀，石细胞较多，可食用部分较少，果心微酸等现象发生。库尔勒香梨出现的上述现象和花粉发育状况、花粉质感有很重要的关系，而花丝是花粉发育过程中营养物质、水分、矿质元素以及激素等物质的重要运输通道，所以很有必要对花丝的细胞结构进行研究，为探明花粉发育过程奠定基础，为库尔勒香梨的繁殖生物学研究提供基础方法。
[0004]目前，国内科研工作者在研究库尔勒香梨花丝细胞结构中所使用的方法主要采用常见的艾氏苏木精整体染色法，但艾氏苏木精整体染色法配制溶液较为复杂，一般需要敞口后熟2个月以上，染色时间不宜把握，而且对纤维素染色较重，不能很好地观察花丝内部各种细胞的结构。
[0005]目前，关于操作简便的库尔勒香梨花丝细胞立体染色方法，能使库尔勒香梨花丝的表皮细胞、中层细胞和输导组织结构清楚着色，各部分细胞区分明显的研究还未见报道。在中国专利公开号CN1280193A、CN103323313A、CN 103033409 A等这些文献中公开了细胞或某一种细胞的染色方法，但是，本领域熟知不同的植物其细胞结构差异性极大，对于同一植物不同器官的细胞结构也是具有明显的差异，现有报道的现有技术并不适用于库尔勒香梨花丝细胞的染色。因此在研究库尔勒香梨花丝细胞的立体染色方法时需要经过大量的劳动，并且需要付出创造性的劳动才能够获得，提供一种操作方法简单，染色时间易于控制，可适用于大规模机械化处理，同时节约时间和材料的库尔勒香梨花丝细胞立体染色方法，具有现实的意义和作用。
【发明内容】
[0006]针对目前未见操作简便的库尔勒香梨花丝细胞立体染色方法，使库尔勒香梨花丝的表皮细胞、中层细胞和输导组织结构清楚着色，各部分细胞区分明显的研究的技术现状，以及现有常见的艾氏苏木精整体染色法配制溶液较为复杂，一般需要敞口后熟2个月以上，染色时间不宜把握，而且对纤维素染色较重，不能很好地观察花丝内部各种细胞结构的缺点和不足，本发明旨在于提供一种库尔勒香梨花丝细胞立体染色方法，能够将库尔勒香梨花丝细胞的表皮细胞、花丝中层细胞和输导组织细胞清楚着色，明显区分，有立体染色效果，且操作方法简单，染色时间易于控制，可适用于大规模机械化处理，同时节约时间和材料，不需要加盖载玻片即可直接观察，也可以经酒精溶液、二甲苯处理后制作成永久切片，用于研究库尔勒香梨花丝内部结构以及花丝在花粉发育过程中的作用。
[0007]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
通过在库尔勒香梨花期时，从树体上采摘花丝固定在FAA液体中，更换三次FAA液体，并将装有花丝的固定液保存在4±0.5°C冰箱中，利用浸泡、包埋、修蜡块等技术制备获得样品切片，通过改进的苏木精染液对样品切片进行染色，使得切片呈现黑色，并利用蒸馏水对切片进行洗色和利用氯化铝溶液对切片进行分色，从而制作永久切片，在温度为380C -420C的烘箱烘烤永久切片12-24h，直至永久切片烘干，用高倍显微镜拍照，并观测库尔勒香梨花丝的细胞结构。其中，改进的苏木精染液为4%苏木精无水酒精溶液、30%过氧化氢溶液、碘-碘化钾溶液和10%硫酸铝钾溶液按照体积比20:1:15:10进行混合，静置Ih制备而成，并且碘-碘化钾溶液制备为将30ml蒸馏水加热，加入Ig碘化钾，待碘化钾充分溶解后，再加入Ig碘，静置一个星期后获得。通过利用本发明方法对库尔勒香梨花丝细胞进行立体染色，并对其染色效果进行分析，能够将库尔勒香梨花丝细胞的表皮细胞、花丝中层细胞和输导组织细胞清楚着色，明显区分，有立体染色效果，且操作方法简单，染色时间易于控制，可适用于大规模机械化处理，同时节约时间和材料，可见，本发明方法获得了显著的技术效果。
[0008]具体地，本发明提供了一种库尔勒香梨花丝细胞立体染色方法，具体的染色方法步骤如下:
(I)样品固定:在库尔勒香梨花期时，从树体上采摘花丝固定在FAA液体中，第3天更换一次FAA液体，第7天再更换一次FAA液体，第15天再更换一次FAA液体，并将装有花丝的固定液保存在4 ± 0.5 °C冰箱中。
[0009]所述的FAA液体为:分别配置60%酒精溶液和40%甲醛溶液，并按照体积比为60%酒精溶液:冰乙酸:40%甲醛溶液=90:5:5，将这三种液体混合，即为制备的FAA液体。
[0010](2)切片处理:取出步骤(I)FAA液体中的样品，用50%的乙醇浸洗15min，50%的乙醇浸泡1.5h，70%的乙醇浸泡1.5h，80%的乙醇浸泡1.5h，90%的乙醇浸泡1.5h，更换90%的乙醇，再次浸泡1.5h，无水乙醇浸泡lh，更换无水乙醇，再次浸泡lh，无水乙醇和二甲苯混合溶液浸泡2h，二甲苯浸泡50 min，更换二甲苯溶液，再次浸泡50min，二甲苯和石蜡混合溶液在39 0C恒温箱内浸泡12h，在62-63 °C恒温箱内石蜡溶液中浸泡，每6 h换一次干净的、过滤过的石蜡溶液，一共更换3-5次，包埋，待纸盒内蜡液凝固后，自来水浸泡8h，晾干，修蜡块，用石蜡切片机将库尔勒香梨花丝切成12-14um厚，放到干净的载玻片上，滴水展片，40°C展片台展片l_2h，至蜡片完全展开，二甲苯脱蜡lOmin，在二甲苯和无水乙醇的混合溶液浸泡5min，95%体积的乙醇浸泡3min，90%的乙醇浸泡3min，80%的乙醇浸泡3min，70%的乙醇浸泡3min，50%的乙醇浸泡3min，30%的乙醇浸泡3min，蒸馈水浸泡lmin。
[0011]所述的无水乙醇和二甲苯混合溶液:按照体积比为无水乙醇:二甲苯溶液=1:1的比例混合后的溶液。
[0012]所述的二甲苯和石蜡混合溶液混合溶液:按照体积比为二甲苯:石蜡溶液=1:1的比例混合后的溶液。
[0013]所述的包埋为:将蜡液中的库尔勒香梨花丝连同蜡液倒到纸盒中。
[0014](3)染色:利用改良的苏木精染液对步骤(2)中处理好的切片进行染色，染色时间为20-30min，颜色呈现黑色。
[0015]所述的改进的苏木精染液:将4%苏木精无水酒精溶液、30%过氧化氢溶液、碘-碘化钾溶液和10%硫酸铝钾溶液按照体积比20:1:15:10进行混合，静置lh，即为制备获得改进的苏木精染液；其中碘-碘化钾溶液制备为将30ml蒸馏水加热，加入Ig碘化钾，待碘化钾充分溶解后，再加入Ig碘，静置一个星期后即可制备所得。