根据组织的位置与大小，修正蜡条，且各个面要削得平整，呈梯形，底部面积大便于固定。之后用加热的刀片融化碎蜡，将其固定在小木块上，固定蜡条时要注意组织材料包埋位置，切勿造成损失。
[0047]8)、切片:用莱卡切片机将蜡条切成薄片，切片厚度设置为6 μπι。
[0048]9)、贴片:在载玻片的一端，滴一滴绿豆大小的甘油蛋白粘片剂(也即蛋清+甘油等量混合)，用干净的手指涂抹成均匀的薄层，再滴加I滴蒸馏水，用昆虫针将切好的蜡片移至玻片上，再将玻片在酒精灯上来回过热几次，使蜡片平展开，用吸水纸除去多余的水，置于烘干器上待其干燥，烘干器温度设置为38°C。
[0049]10)、将干燥后的蜡片用TO型生物透明溶剂脱蜡2次，每次15?20min，尽量脱蜡干净；再经TO型生物透明试剂与纯酒精等量混合液一纯酒精一95%酒精一80%酒精—70%酒精一50%酒精一30%酒精一15%酒精一蒸馏水，各3?5min。
[0050]11)、染色:采用苏木精-伊红染色液(HE染色)进行染色处理。也即用苏木精染色液滴染5?6min，用细水流冲洗掉多余的染色液，时间控制在35?45s。再用伊红染色液染色5?6min，立即置于70%的酒精中洗涤3?5秒。
[0051]12)、将染色后的玻片再经95%酒精2-3min—纯酒精一纯酒精一T0型生物透明试剂与纯酒精等量混合液一TO型生物透明试剂一TO型生物透明溶剂，各5?7min。
[0052]13)、封藏和贴标签:用加拿大树脂胶滴在组织所在面积的切片上，盖玻片背面滴上一滴TO型生物透明溶剂，反盖在切片上，速度要放慢，切勿产生气泡。然后用昆虫针缓慢的调整好盖玻片，在切片的右端贴上标签，注明器官的名称和制作日期。
[0053]14)、观察:将做好的石蜡切片在生物光学显微镜下进行观察和拍照。
[0054]上述操作中，组织材料处理过程中对材料的挑移均采用组织挑移工具。而所述的固定液是由下列试剂按体积百分比配制而成，具体为:饱和苦味酸50份，甲醛25份，冰醋酸5份，70%酒精10份。石蜡是采用熔点为52-54°C的生物组织用石蜡。本发明涉及的浓度均为质量百分比。
[0055]实施例1:
[0056]1)、取材:在生理盐水中，解剖羽化后10?11小时之间的雄成虫，移出内生殖器，取出精巢，整个取材时间控制在I分钟以内，确保材料的新鲜度。
[0057]2)、固定:利用组织挑移工具，将各精巢组织移至固定液中进行固定，时间为5小时。
[0058]3)、冲洗与脱水:因固定液有黄色，因此试验材料需经70%的酒精清洗3次，每次清洗时间均控制在20min，除去固定液黄色。再经80%— 95% —纯酒精洗涤3次，每次时间15min0
[0059]4)、透明:组织材料经纯酒精+TO型生物透明溶剂等量混合液一TO型生物透明溶剂，各 12min。
[0060]5)、浸蜡:熔蜡器内进行，温度设定为60°C，材料经TO型生物透明溶剂+石蜡等量混合液一石蜡溶剂一石蜡溶剂，各15min。
[0061]6)、包埋:用两根昆虫针挑取精巢，快速的移至有一半蜡液的组织包埋盒内的距一端1/3的位置，再将包埋盒加满蜡液，置于冷却台面进行冷却处理。
[0062]7)、修整和固定:用刀片小心切去材料周围多余的蜡，根据组织的位置与大小，修正蜡条，且各个面要削得平整，呈梯形，底部面积大易于固定。蜡条高3cm，下底边长0.8cm,上底边长0.5cm。之后利用加热的刀片融化碎蜡，将其固定在小木块上，固定蜡条时要注意组织材料包埋位置，切勿造成损失。
[0063]8)、切片:用莱卡切片机将蜡条切成薄片，切片厚度设置为6 μπι。
[0064]9)、贴片:在载玻片的一端(2/5处)，滴一滴绿豆大小的甘油蛋白粘片剂，用干净的手指涂抹成均匀的薄层，再滴加I滴蒸馏水，用昆虫针将切好的蜡片移至玻片上，再将玻片在酒精灯上来回过热几次，使蜡片平展开，用吸水纸除去多余的水，置于烘干器上待其干燥，烘干器温度设置为38°C。
[0065]10)、将干燥后的蜡片用TO型生物透明溶剂脱蜡2次，每次15min ;再经TO型生物透明试剂与纯酒精等量混合液一纯酒精一95%酒精一80%酒精一70%酒精一50%酒精—30%酒精一15%酒精一蒸馏水，各5min。
[0066]11)、染色:采用苏木精-伊红染色液(HE染色)进行染色处理。用苏木精染色液滴染6min，用细水流冲洗掉多余的染色液，时间控制在40秒。再用伊红染色液染色5min，立即用70%的酒精中洗涤5秒。
[0067]12)、将染色后的玻片再经95%酒精2min —纯酒精一纯酒精一TO型生物透明试剂与纯酒精等量混合液一TO型生物透明试剂一TO型生物透明溶剂，各5min。
[0068]13)、封藏和贴标签:用加拿大树脂胶滴在组织所在面积的切片上，盖玻片背面滴上一滴TO型生物透明溶剂，反盖在切片上，速度要放慢，切勿产生气泡。然后用昆虫针缓慢的调整好盖玻片，在切片的右端贴上标签，注明器官的名称和制作日期。
[0069]14)、观察:将做好的石蜡切片在生物光学显微镜下进行观察和拍照。
[0070]石蜡切片技术作为一种重要的组织细微结构观察手段，在动植物研究中已经很成熟，但针对不同的处理材料，在试验手段与步骤上均存在差异。本方法针对茶尺蠖雄成虫内生殖器官，分别确定了取材时间和某些关键步骤的独特处理方式，但不仅仅局限于茶尺蠖，对及其它种均具有重要的指导意义。根据茶尺蠖雄成虫内生殖器官的特点，本发明通过上述制备方法及采用独特的组织挑移工具，其制作的切片组织具有切片效果更好，显微观察组织结构更为清晰等显著特点，丰富了茶尺蠖雄成虫生殖生理的研究，对种间鉴定、繁殖规律等研究具有重要的意义。
【主权项】
1.一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，其特征在于:至少包括取材、固定、冲洗脱水、透明、浸蜡、包埋、修整固定、切片、贴片、脱蜡、染色和封片步骤；其中: 固定步骤中，固定液的主要成分按体积百分比为:饱和苦味酸50份，甲醛25份，冰醋酸5份，70%酒精10份；固定方式为在室温条件下，固定4?8h。2.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，其特征在于:所述取材步骤中，取材时间控制在成虫羽化后10?15h。3.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，其特征在于:所述透明步骤中，组织材料经纯酒精与二甲苯溶剂等量混合液处理10?12min后再经由二甲苯溶剂处理10?12min ； 浸蜡步骤于熔蜡器内进行，温度设定60°C，材料经TO型生物透明溶剂与石蜡等量混合液浸13?15min后，至石錯溶剂中浸13?15min后，继续再移至新的石錯溶剂内浸13?15min ； 脱蜡步骤中，将干燥后的蜡片用TO型生物透明溶剂脱蜡2次，每次15-20min ;再依次经TO型生物透明试剂与纯酒精等量混合液、纯酒精、95 %酒精、80 %酒精、70 %酒精、50 %酒精、30%酒精、15%酒精以及蒸馏水，各脱蜡3?5min。4.根据权利要求3所述的一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，其特征在于:所述染色步骤采用HE染色处理:用苏木精染色液滴染5?6min，并使用水流从载玻片顶端冲洗多余的染色液，时间40s ;再用伊红染色液染色5?6min，之后于70%的酒精中洗涤3?5秒；将染色后的玻片再依次经95%酒精洗涤2?3min、纯酒精洗涤5?7min、纯酒精洗涤5?7min、T0型生物透明试剂与纯酒精等量混合液洗涤5?7min、T0型生物透明试剂洗涤5?7min、TO型生物透明溶剂洗涤5?7min ;进入封片步骤； 封片步骤中，用加拿大树脂胶滴在切片上的组织所在面，盖玻片背面滴上一滴TO型生物透明溶剂，反盖在上述面上；然后调整好盖玻片，在切片处贴上标签。5.根据权利要求1或2或3或4所述的一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，其特征在于:冲洗脱水步骤中，固定后的组织材料分别经70%的酒精清洗3次，每次清洗时间均控制在15?20min ;再依次经80%酒精、95%酒精、纯酒精分别洗涤3次，每次时间13?15min，进入包埋步骤； 包埋步骤中，挑取包埋组织，移至有一半蜡液的组织包埋盒内的1/3的位置，再将包埋盒加满蜡液，置于冷却台面进行冷却处理，之后进入修整固定步骤； 修整固定步骤中，用刀片切去材料周围多余的蜡，根据组织的位置与大小，修正蜡条，且各个面要削得平整，呈梯形，之后用加热的小刀融化碎蜡，将其固定在小木块上，进入切片步骤； 切片步骤中，用莱卡切片机将蜡条切成薄片，切片厚度设置为6 μ m，之后进入贴片步骤； 贴片步骤中，在载玻片的一端，滴一滴甘油蛋白粘片剂，抹成均匀的薄层，再滴加I滴蒸馏水，用昆虫针将切好的蜡片移至玻片上；再将玻片在酒精灯上来回过热，使蜡片平展开，用吸水纸除去多余的水，置于烘干器上待其干燥，烘干器温度设置为38°C。6.一种应用于上述权利要求1的制备方法中的组织挑移工具，其特征在于:本挑移工具至少包括由单根金属丝盘绕回旋而成的盘状蚊香构造的托撑体(10)，以及由该托撑体(10)处向外延伸的手柄(20);所述托撑体(10)呈便于组织切片平整放置的平面结构，且构成该平面盘状蚊香构造的各相邻环间间隙构成供溶液下漏的漏口(11)。7.根据权利要求6所述的组织挑移工具，其特征在于:所述托撑体(10)所用金属丝为铜丝或镍丝。8.根据权利要求6所述的组织挑移工具，其特征在于:所述手柄(20)长度为60mm?100mm，托撑体(10)的最大直径为4mm?8_，构成托撑体的各相邻环间间隙< 1mm。9.根据权利要求6所述的组织挑移工具，其特征在于:所述构成托撑体(10)的单根金属丝的最外端向外直线延伸以构成前述手柄(20)，于该手柄(20)延伸方向的末端布置便于握持的把手(30)。
【专利摘要】本发明属于昆虫解剖生理学技术领域，具体涉及一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法及应用该方法的组织挑移工具。本制备方法的固定步骤中，固定液的主要成分按体积百分比为：饱和苦味酸50份，甲醛25份，冰醋酸5份，70％酒精10份；固定方式为在室温条件下，固定4～8h。通过该种方法所制作的组织切片，其具有切片效果更好、显微观察组织结构更为清晰等显著特点。组织挑移工具包括由蚊香盘状构造的托撑体，以及由该托撑体处向外延伸的手柄；托撑体呈便于组织平整放置的平面结构，且构成该平面盘状蚊香构造的各相邻环间间隙构成供溶液下漏的漏口。该工具能可靠实现不同处理过程中对组织的移动，并有效确保了组织的完整性。
【IPC分类】G01N1/30
【公开号】CN105136548
【申请号】CN201510581839
【发明人】张家侠, 孙钦玉, 赵强, 夏先江
【申请人】安徽省农业科学院茶叶研究所
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月11日