一种快速检测量子点与hat标签相互作用的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及纳米生物技术领域，具体涉及一种快速检测量子点与HAT标签相互作 用的方法。
【背景技术】
[0002] 量子点（QDs)作为一种新型荧光材料，具有激发光谱宽、发射光谱窄而对称、颜色 可调、抗光漂白和荧光寿命长等优点，逐渐使其在生物分析检测中得到广泛应用。
[0003] 目前，在生物标记中应用最广泛的是金属有机溶剂法合成的CdSe/ZnS量子点。但 是其油溶性限制其生物应用。因此，可通过亲水性配体交换、两亲性配体封装、硅烷涂层等 方法将脂溶性量子点转换为水溶性量子点，从而使其表面功能化。水溶性量子点可与多肽、 蛋白和DNA通过共价偶联或静电吸附的方法制备量子点荧光探针。
[0004] 将量子点与荧光多肽结合，当它们之间的距离小于Raster半径时，会发生非辐射 能量转移，即焚光能量共振转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET)。从 而通过荧光检测，可以分析彼此之间的相互作用。
[0005] 另一方面，毛细管电泳作为一种高分辨率、高灵敏、高通量及低样品消耗的微分离 技术，在生物分析领域具有广阔的应用前景。同时，通过将荧光检测与毛细管电泳相结合， 大大提高了检测限，拓展了毛细管的应用。且毛细管内的方法可实时检测生物分子微量的 变化，比毛细管外的方法更灵敏、便捷、迅速。
[0006] HAT标签是天然组氨酸亲和标签，序列为KDHLIHNVHKEFHAHAHNK，其中带有3个正 电荷，与量子点表面的负电荷容易发生静电吸附作用，从而导致量子点聚集，这限制了 HAT 标签的应用。
[0007] 本方法通过荧光染料（ΑΤΤ0 590)标记含有HAT标签的多肽与量子点（QDs)在毛 细管内相互作用，将量子点和染料标记的多肽按不同摩尔比例先后微量注入毛细管内，通 过荧光毛细管电泳检测两者之间在毛细管内的相互作用，发生FRET，并测定受体检测通道 (625nm)与供体检测通道（565nm)的峰值面积之比与含有HAT标签多肽摩尔浓度的关系，绘 制峰面积比-浓度的拟合曲线。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是现有技术中尚无良好检测HAT标签方法的不足，提供 一种快速检测量子点与HAT标签相互作用的方法。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为，一种快速检测量子点与HAT 标签相互作用的方法，其特征在于，步骤如下：
[0010] (1)通过荧光染料（ΑΤΤ0 590)标记含有HAT标签的多肽与量子点（QDs)在毛细管 内相互作用，将量子点和染料标记的多肽按不同摩尔比例先后微量注入毛细管内，通过荧 光毛细管电泳检测两者在毛细管内的相互作用。
[0011] ⑵并测定受体检测通道（625nm)与供体检测通道（565nm)的峰值面积之比与含 有HAT标签多肽摩尔浓度的关系，绘制峰面积比-浓度的拟合曲线。
[0012] 进一步地，所述的多肽与量子点生物探针在毛细管内的进样顺序为先进电泳速度 慢的量子点，再进电泳速度快的荧光多肽。
[0013] 作为优选，所述荧光染料标记的HAT多肽，染料标记的多肽C端具有HAT标签序列 可以偶联QDs，N端偶联荧光染料ATTO 590, QDs与荧光染料之间能产生荧光共振能量转移 现象。
[0014] 进一步地，所述的量子点为含有Zn的量子点。
[0015] 作为优选，所述的量子点为 CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe 或者 CdTe/ZnSe。
[0016] 本发明所取得的有益效果是，本发明提供的可用于一种快速检测量子点与HAT标 签相互作用的方法，操作简单，可重复性高，进一步拓展了量子点探针在生物分析领域的应 用。
【附图说明】
[0017] 图I :ΑΤΤ0 590-HAT和QDs在毛细管内自组装的电泳图（实线，565nm，QDs检测通 道；虚线，625nm，ATT0 590 检测通道），（a)QDs，（b)l:l(ATT0 590-HAT:QDs，下同），（c)2:l， (d)4:l，（e)8:l，（f)16:l〇
[0018] 图2 :S625/S565的值与ATTO 590-HAT摩尔浓度的关系。
【具体实施方式】
[0019] 本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明 之用，而不应被解释为本发明实施的限制。
[0020] 实施例1
[0021] ATTO 590-HAT与CdSe/ZnS QDs在毛细管内的相互作用
[0022] 1、脂溶性QDs经GSH转换为水溶性QDs
[0023] 将18mg GSH，5mg Κ0Η，250 μ L甲醇混匀，取40 μ L混合溶液加入200 μ L脂溶性量 子点中，振荡30min。振荡结束后，加入200 yL ImM NaOH，脂溶性量子点即转移到水相中。 取出上层量子点，加入ImL甲醇与30 μ L NaCl (30mg/mL)沉淀，溶于硼酸缓冲液（pH 7. 4， IOmM)中。反复沉淀两次，最后溶于200 μ L硼缓冲液（pH 7. 4, IOmM)中。
[0024] 2、多肽合成与标记
[0025] 多肽 DDSSGGKDHLIHNVHKEFHAHAHNK采用 Fmoc 固相合成法合成。用 HBTU/HOBt (1:1) 活化Fmoc保护的氨基酸，偶联30min ;用碱性溶剂20%哌啶脱保护，暴露出氨基；采用 HBTU和HOBt活化下一个氨基酸上的羧基，与树脂上的氨基偶联，形成肽键；重复上述步 骤，反复循环添加氨基酸，直至合成完成。再用20%哌啶脱保护，暴露出氨基，用EDC/ HOBt(I = I)活化ATT0-590的羧基，进行染料的标记。用切割试剂（TFA，乙二硫醇，水和 TIS，94:2. 5:2. 5:1，v/v)将多肽从树脂上切割下来，然后经过冰乙醚沉淀，离心收集沉淀， 经过HPLC分离纯化，冷冻干燥得到的最终产品ATTO 590-HAT。
[0026] 3、量子点生物探针的组装
[0027] ATTO 590-HAT与QDs分别按照摩尔比1:1，2:1，4:1，8:1，16:1微量注入毛细管内， 进样时间分别为10S，进样间隔20s，通过毛细管电泳检测两者的相互作用。随着随着ATTO 590-HAT与QDs摩尔比的增大，FRET逐渐增强（图1)。
[0028] 4、曲线拟合
[0029] 通过对不同摩尔比条件下的ATTO 590-HAT受体检测通道峰面积与 QDs供体检测通道峰面积比（S625/S565)，绘制出拟合曲线（图2)，得出曲线方程y =-0. 0012x2+0. 8888x+0.0814。
[0030] 实施例2
[0031] Cy5-HAT与CdSe/ZnS QDs在毛细管内的相互作用
[0032] 步骤1一 3同实施例1。
[0033] 4、相互作用变化的曲线拟合
[0034] 通过对不同摩尔比条件下的Cy5-HAT受体检测通道峰面积与QDs供体检测通道峰 面积比（S 625/S565)，绘制出拟合曲线，得出曲线方程y = -0. 0008χ2+0. 0. 0742X+0. 1703。
[0035] 以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完 全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更及修改。本项发明的技术性 范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。
【主权项】
1. 一种快速检测量子点与HAT标签相互作用的方法，其特征在于， 荧光染料ATTO 590标记的含有HAT标签多肽与量子点（QDs)在毛细管内相互作用，将 量子点和染料标记的多肽按不同摩尔比例先后微量注入毛细管内，通过测定受体检测通道 (625nm)与供体检测通道（565nm)的峰值面积之比与含有HAT标签多肽摩尔浓度的关系， 绘制峰面积比-浓度的拟合曲线，通过荧光毛细管电泳检测两者之间在毛细管内的相互作 用。2. 根据权利要求1所述的一种快速检测量子点与HAT标签相互作用的方法，其特征在 于，所述染料标记的HAT标签多肽和量子点均为纳升级。3. 根据权利要求1所述的一种快速检测量子点与HAT标签相互作用的方法，其特征在 于，所述的量子点为含有Zn的量子点，为CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。4. 根据权利要求1所述的一种快速检测量子点与HAT标签相互作用的方法，其特征在 于，所述多肽含有天然组氨酸亲和标签（HAT-tag)，序列为KDHLIHNVHKEFHAHAHNK，其中含 有6个组氨酸，通过组氨酸的咪唑基与量子点配位结合，结合稳定。5. 根据权利要求1所述的一种快速检测量子点与HAT标签相互作用的方法，其特征在 于，染料标记的多肽C端具有HAT标签序列，N端偶联荧光染料ATTO 590。
【专利摘要】本发明涉及纳米生物技术领域一种快速检测量子点与HAT标签相互作用的方法，其特征在于荧光染料ATTO？590标记的含有HAT标签多肽与量子点(QDs)在毛细管内相互作用，将量子点和染料标记的多肽按不同摩尔比例先后注入毛细管内，测定受体检测通道(625nm)与供体检测通道(565nm)的峰值面积之比与含有HAT标签多肽摩尔浓度的关系，绘制峰面积比-浓度的拟合曲线，通过毛细管电泳检测两者在毛细管内的相互作用。本发明提供了一种可以准确、快速、灵敏的检测量子点与HAT标签相互作用的方法，操作简单，可重复性高，进一步拓展了量子点探针在生物分析领域的应用。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105136760
【申请号】CN201510560728
【发明人】王建浩, 李进晨, 柴宏, 张晨澄, 陈瑶, 滕一万, 蒋鹏举, 邱琳, 王车礼, 柳丽, 杨丽, 樊杰, 刘菲菲
【申请人】常州大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月6日