用于检测磺胺药物的试剂盒和试纸条及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析领域中用于检测磺胺药物的试剂盒和试纸条及其应用。
【背景技术】
[0002] 磺胺药物是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的化学药物，其中应用较广并有确切疗 效的有数十种，由于其价格便宜、使用方便，广泛应用于动物疾病防治和促生长。磺胺药物 的不合理使用在畜牧产品中产生了严重的残留现象，食品中残留的磺胺药物会危害人们的 身体健康，长期摄入含有磺胺药物残留的食物可引起细菌耐药性增加，产生肾脏毒性，影响 造血系统等毒副作用。
[0003] 随着人们对食品安全的日益重视，欧盟、中国、美国、日本等国家相继对动物源性 食品中磺胺药物最大残留限量值作出了规定，其中欧盟和中国规定磺胺药物总量的最高残 留限量为IOOppb。
[0004] 目前磺胺药物的检测方法主要有仪器法（包括高效气相色谱、高效液相色谱以及 色质联用技术等）、微生物法、免疫分析方法以及受体分析方法等，这些方法各有特点：仪 器法准确、可靠、灵敏度高，是一种确证方法，但是不适合现场快速检测；微生物法可同时检 测多种抗生素，但灵敏度不高、检测时间长，且无法定量；免疫分析方法基于抗原抗体的特 异结合，具有灵敏度高、特异性强、可定量检测等优势，但由于灵敏度高且可识别同一类药 物的抗体难以获得，制约了其在兽药残留检测领域中的应用。如能开发出可同时检测多种 磺胺药物的产品将有助于磺胺药物的检测。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何检测多种磺胺药物。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测磺胺药物的试剂盒。
[0007] 本发明所提供的一种检测磺胺药物的试剂盒，包括包被原和酶标记物；所述包被 原为蛋白质flop ;所述酶标记物是将标记酶和4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸偶联在一 起得到的偶联物；所述蛋白质flop为如下a)或b)的蛋白质：
[0008] a)由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0009] b)将SEQ ID No. 1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加由a)衍生的蛋白质。
[0010] 上述试剂盒中，所述标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶；辣根过氧化物 酶可采用现有技术中的多种方法将其与4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸进行偶联，如二 环己基碳二亚胺偶联法等。
[0011] 上述试剂盒还包括如下中的至少一种：磺胺二甲基嘧啶标准溶液、底物显色液、终 止液、洗涤液、样品稀释液、包被缓冲液和封闭液。
[0012] 上述试剂盒中，所述磺胺二甲基嘧啶标准溶液可以是一定浓度范围内的多种浓 度的标准溶液，例如可以在〇-l〇〇ng/mL之间，如磺胺二甲基嘧啶的浓度分别为50ng/mL、 25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. 125ng/mL和 L 6ng/mL〇
[0013] 当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由E液和F液组成，所述E液可为 过氧化脲溶液或过氧化氢溶液（具体如质量百分含量为2 %的过氧化脲溶液），所述F液可 为四甲基联苯胺溶液或邻苯二胺溶液（具体如质量百分含量为1 %的四甲基联苯胺溶液）。 所述终止液可为硫酸溶液，其浓度可为1-2M (如0. 2M)。
[0014] 上述试剂盒中，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液，在本发明的一个实施例中，所述洗涤 液具体为含有吐温20和叠氮化钠的浓度为0. 01M，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液；吐温-20 在所述洗涤液中的体积含量为〇. 05%，叠氮化钠在所述洗涤液中的浓度为5mg/mL。
[0015] 上述试剂盒中，所述包被缓冲液的pH为8. 0,由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水， 所述溶质及其浓度为：20mMTris、30mM MgCl2。
[0016] 上述试剂盒中，所述封闭液为磷酸盐缓冲液；在本发明的一个实施例中，所述封闭 液具体为pH 7. 4,含脱脂奶粉的浓度为0. 02M的磷酸盐缓冲液；脱脂奶粉在所述封闭液中 的浓度为20mg/mL。
[0017] 所述包被缓冲液和所述封闭液也可以是本领域常用的其它包被缓冲液和封闭液。
[0018] 上述试剂盒中，所述样品稀释液具体为pH值为8.0,由溶剂和溶质组成；溶剂为 水，溶质及其浓度为：20mM Tris、5mM MgCl2、2% (质量百分含量）脱脂奶粉、l:1500(v/v) 的6-羟甲基-7, 8二氢蝶呤焦磷酸盐（DHPPP)。
[0019] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述试剂盒的制备方法。
[0020] 本发明所提供的所述试剂盒的制备方法，包括如下（1)或（2)的步骤：
[0021] (1)将所述包被原和所述酶标记物分别单独包装的步骤；
[0022] (2)将所述包被原、所述酶标记物、所述磺胺二甲基嘧啶标准溶液、所述底物显色 液、所述终止液、所述洗涤液、所述样品稀释液、所述包被缓冲液和所述封闭液分别单独包 装的步骤。
[0023] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测磺胺药物的胶体金试纸。
[0024] 本发明所提供的一种检测磺胺药物的胶体金试纸，包括相互连接的样品垫、胶体 金垫、反应膜和吸收垫；所述反应膜位于所述胶体金垫和所述吸收垫之间；所述胶体金垫 包被有胶体金标记的带有HIS标签的所述的蛋白质flop ;所述反应膜上含有检测线和质检 线，所述检测线包被有4- (4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸和载体蛋白，所述质检线包被有抗 所述HIS标签的单克隆抗体；所述蛋白质flop为如下a)或b)的蛋白质：
[0025] a)由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0026] b)将SEQ ID No. 1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加由a)衍生的蛋白质。
[0027] 上述胶体金试纸中，所述样品垫的末端与所述胶体金垫的始端相连，所述胶体金 垫的末端与所述反应膜的始端相连，所述反应膜的末端与所述吸收垫的始端相连。
[0028] 上述胶体金试纸中，所述反应膜上的检测线（T线）和质检线（C线）均是与所述 胶体金试纸的长相垂直的条带状；所述检测线位于近于所述胶体金垫末端的一侧；所述质 检线位于远离所述胶体金垫末端的一侧。
[0029] 上述胶体金试纸中，所述载体蛋白可为卵清白蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋 白、血蓝蛋白、鼠血清白蛋白、甲状腺球蛋白或兔血清白蛋白，具体可为卵清白蛋白。
[0030] 上述胶体金试纸中，所述抗所述HIS标签的单克隆抗体具体可为鼠抗HIS标签单 克隆抗体。
[0031] 上述胶体金试纸中，所述样品垫可为纤维素滤膜；所述反应膜可为硝酸纤维素膜； 所述吸收垫可为吸水纸；所述胶体金垫可为包被有胶体金标记的蛋白质flop的玻璃纤维 膜；样品孔位于所述胶体金试纸顶端，所述样品垫的始端为所述胶体金试纸顶端。
[0032] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述胶体金试纸的制备方法。
[0033] 本发明所提供的所述胶体金试纸的制备方法，包括如下（1)或（2)的步骤：
[0034] (1)分别制备所述的检测磺胺药物的胶体金试纸中所述样品垫、所述胶体金垫和 所述反应膜；
[0035] (2)将步骤（1)得到的所述样品垫、所述胶体金垫、所述反应膜和所述吸收垫相 互连接，得到所述反应膜位于所述胶体金垫和所述吸收垫之间的检测磺胺药物的胶体金试 纸。
[0036] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测样品中磺胺药物的方法。
[0037] 本发明所提供的一种检测样品中磺胺药物的方法，为如下I或II所示的方法：
[0038] I、检测样品中磺胺药物的方法包括如下步骤：
[0039] 1)将待测样品进行前处理，得到待测样品溶液；
[0040] 2)用所述试剂盒对所述待测样品溶液进行检测；
[0041] 所述待测样品为牛奶：将牛奶用上述的样品稀释液按1:5的体积比进行稀释， 4°C、1000 Orpm离心，取上清液，作为待测样品溶液；
[0042] 所述待测样品为奶粉：称取Ig奶粉，溶于5mL上述的样品稀释液中，混合均匀，作 为待测样品溶液。
[0043] 所述待测样品为尿液：将尿液直接作为待测样品溶液；
[0044] 所述待测样品为鸡肉、鱼、虾或蛋：将所述待测样品匀浆处理，得到均质样品，将每 5g所述均质样品加入IOmL乙腈水溶液中，上下颠倒震荡10min，5000rpm离心10min，取上 清，氮气吹干，用ImL上述的样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样品溶液；乙腈水溶液 中乙腈和水的体积比为9:1 ;
[0045] 所述待测样品为蜂蜜：将每5g所述待测样品加入到15mL去离子水中，混合，得到 混合液；将所述混合溶液用Oasis固相萃取柱进行纯化，用甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹 干，用ImL上述的样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样品溶液。
[0046] II、检测样品中磺胺药物的方法包括如下步骤：
[0047] 1)将待测样品进行前处理，得到待测样品溶液；
[0048] 2)用所述胶体金试纸对所述待测样品溶液进行检测；
[0049] 所述胶体金试纸检测结果的判断：
[0050] 阴性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性。
[0051] 阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性。
[0052] 无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸卡均判为无效。
[0053] 上述检测样品中磺胺药物的方法中，所述方法为非疾病诊断目的的方法和/或非 治疗目的的方法。
[0054] 上述的试剂盒，或上述的胶体金试纸，或上述的方法中，所述磺胺药物为下述中的 至少一种：磺胺异噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺间甲氧嘧 啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、 磺胺氯哒嗪、磺胺乙氧哒嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧 啶