通过质谱分析用复用内标物对蛋白质和蛋白质修饰的绝对定量的制作方法
【专利说明】通过质谱分析用复用内标物对蛋白质和蛋白质修饰的绝对 r-^-i 日 疋垔
[0001] 本申请要求2013年6月7日提交的共同未决的美国申请第61/832, 380号的优先 权，其明确地以全文引用的方式并入本文中。
[0002] 质谱（MS)与用稳定重同位素标记的内标肽结合提供了对生物和其它样品中的 肽、多肽和蛋白质的快速、准确并且精确的绝对定量。
[0003] 本发明MS方法提供了通过高分辨率质谱分析使用复用内标同位素物的靶肽定 量。所述方法使用AQUA肽（W0 03/016861)和/或用NeuCode氨基酸合成的重蛋白质（赫 伯特（Hebert)等人，用于复用蛋白质组定量的中子编码的质量签名（Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification),自然美国公司(Nature America, Inc.) 2013 高级在线出版物（Advance Online Publication))。在一个具体实施 方式中，所述方法用于TMT测定。在一个【具体实施方式】中，所述方法用于通用报告子测定 (W02012/005838 ;W0 2012/006406)。
【发明内容】
[0004] -个【具体实施方式】是一种使用复用重肽内标物的至少一个集合通过质谱（MS)在 样品中进行绝对蛋白质或肽定量的方法，其中所述集合内的每种肽含有相同氨基酸序列， 但所述集合内的所述肽相差质量亏损，所述质量亏损通过在至少一个氨基酸分子内的不同 原子上并入重同位素而产生。每个集合内的所述重肽内标物在每种肽内含有相同数目的总 中子，但不同在于，所述氨基酸内的重原子分布为每种肽所特有。每个集合内的所述重肽内 标物在低分辨率质谱分析下分辨为单峰，并且在高分辨率质谱分析下分辨为多峰。每个集 合内的所述重肽内标物在每种肽之间含有小于1道尔顿的质量差异。所述样品可以是生物 样品，所述方法用于诊断测定。所述方法可以用于通用报告子测定。所述方法可以用于多 样品分析。所述方法可以用于多靶分析。所述方法可以用于多样品分析和多靶分析。所述 重肽通过以下方式制备：合成至少两种肽与重氨基酸的同位素物的混合物，产生具有不同 质量亏损的重肽。同位素物通过以确定比例混合固相固定的AQUA肽前体而制备。所述样 品通过实施所述靶蛋白质或肽的裂解而制备。靶肽峰的量可以通过使用已知量的至少两种 同位素物标准肽的标准曲线而获得。所述方法可以用以验证所述靶蛋白质或肽不含同量异 位素干扰。
[0005] -个【具体实施方式】是一种通过以下方式通过质谱进行蛋白质或肽定量的方法： (a)制备含有目的靶蛋白质或肽的样品用于质谱分析，（b)制备多种具有所述靶蛋白质或 肽的至少一种子序列的重同位素标记的肽，（c)将已知浓度下的所述重同位素标记的肽与 所述样品混合，（d)使含有所述制备的样品和所述重同位素标记的肽的混合物经历低分辨 率下的质谱分析，由此获得单累加重肽质谱分析峰与相应单轻肽质谱分析峰，（e)使所述 低分辨率峰经历高分辨率质谱分析，由此获得多个代表所述重同位素异构体肽的质谱分析 峰，（f)生成轻肽强度：重肽强度比，和（g)基于所述重同位素标记的肽的强度对所述多个 质谱分析峰中的每一者的强度进行定量以对所述样品中的蛋白质或肽的量进行定量。所述 重肽通过以下方式制备：合成至少两种肽与重氨基酸的同位素物的混合物，产生具有质量 亏损的重肽。同位素物通过以确定比例混合固相固定的AQUA肽前体而制备。所述样品通 过实施所述靶蛋白质或肽的裂解而制备。靶肽峰的量可以通过使用已知量的至少两种同位 素物标准肽的标准曲线而获得。步骤（f)可以使用来自MS分析的标准曲线的结果。步骤 (f)可以进一步包含制备氨基酸的多种同位素物；使用所述同位素物以生成重肽标准物的 集合；以固定比例混合所述多种含同位素物的肽；在低质量分辨率和高质量分辨率下分离 所述混合的含同位素物的肽；使用低质量分辨率以测定轻：重肽比；和使用高质量分辨率 分离结果制备标准曲线。
[0006] -个【具体实施方式】是一种肽同位素物合成的方法，其中将多种前体氨基酸同位素 物，含有α羧酸酯基的氨基酸以确定比例与含有缀合基团的固相肽合成树脂混合，以通过 所述α羧酸酯基固定化所述同位素物。在使所述前体氨基酸同位素物缀合之后，所述肽合 成树脂混合物包含多种以已知比例缀合到所述树脂的固定化的氨基酸同位素物。包含以已 知比例固定化的所述氨基酸同位素物的所述树脂可以进一步用于肽合成，以产生含有多种 同位素物的重肽集合。
[0007] -个【具体实施方式】是一种肽同位素物合成的方法，包含将多种前体氨基酸同位素 物与含有至少一个已经合成到具有所要序列的前体肽中的氨基酸的固相肽合成树脂混合， 其中所述前体氨基酸同位素物使用标准氨基酸合成程序而变得连接到所述肽的N末端。使 所述前体氨基酸同位素物缀合到所述固定化肽产生含有已知比例的同位素物混合物的重 肽的集合。包含以已知比例固定化的所述氨基酸同位素物的所述树脂可以进一步用于肽合 成，以产生含有多种同位素物的重肽集合。
[0008] -个【具体实施方式】是一种蛋白质同位素物合成的方法，包含在体外或基于细胞的 蛋白质表达系统中使用多种前体氨基酸同位素物以合成具有所要序列的目的蛋白质，其中 所述前体氨基酸同位素物变得并入到所述目的蛋白质中。在所述表达的蛋白质中并入所述 前体氨基酸同位素物产生含有多种同位素物的重蛋白质集合。
[0009] -个【具体实施方式】是一种通过高分辨率质谱使用复用内标肽同位素物进行靶向 肽定量的方法。
[0010] -个【具体实施方式】是一种通过以下方式生成质谱分析的标准曲线的方法：制备氨 基酸的多种同位素物以生成重肽标准物，以固定比例混合所述多种同位素物，以低分辨率 定量或高分辨率定量分离所述混合的同位素物，和使用分离结果以制备标准曲线。
[0011] -个【具体实施方式】是一种通过高分辨率质谱使用一种或多种肽进行靶向肽定量 的方法，所述一种或多种肽通过蛋白水解消化而来源于复用内标蛋白质同位素物。
[0012] -个【具体实施方式】是一种通过以下方式生成质谱分析的标准曲线的方法：制备氨 基酸的多种同位素物以生成重蛋白质标准物，以固定比例混合所述多种同位素物，用蛋白 酶消化同位素物集合，以低分辨率定量或高分辨率定量分离所述混合的同位素物，和使用 分离结果以制备标准曲线，所有肽通过蛋白水解消化而来源于所述蛋白质同位素物集合。
[0013] -个【具体实施方式】是一种通过以下方式生成质谱分析的标准曲线的方法：制备氨 基酸的多种同位素物以生成重蛋白质标准物，以固定比例混合所述多种同位素物，用蛋白 酶消化同位素物集合，和添加一种或多种已知量的独特同位素的独特内标肽，以低分辨率 定量或高分辨率定量分离所述混合的同位素物，和使用分离结果以制备标准曲线，所有肽 通过蛋白水解消化而来源于所述蛋白质同位素物集合，并且用于对相同序列的相应肽进行 绝对定量的所述独特同位素肽通过消化天然蛋白质和重同位素物蛋白质集合而得到。
[0014] -个【具体实施方式】是一种通过以下方式合成单同位素物集合的方法：以确定所要 比例预混合固相固定前体氨基酸。
[0015] -个【具体实施方式】是一种通过以下方式进行的质谱分析分析物定量方法：(a)由 含有具有已知氨基酸序列的肽分析物的样品制备多种包含所述分析物序列的至少部分的 重同位素物标记的标准物；(b)添加已知量的步骤（a)的产物到所述样品中；(c)使所述样 品中的蛋白质裂解以产生肽；（d)对所述样品中的所述多种重同位素物标记的标准物进行 定量；和（e)基于（d)的所述定量，测定所述样品中的分析物的量。所述样品中的所述多种 重同位素物标记的标准物的定量通过高分辨率质谱分析行。步骤（a)的每种标准物通过并 入不同元素的重原子但具有相同总数目的中子而不同于其它标准物。将不同重原子并入到 所述标准物中在所述标准物之间产生质量亏损。所述多种重同位素物标记的标准物的峰值 强度在高分辨率MS下含有多个可分辨峰，所述多个可分辨峰中的每一者代表所述多种重 同位素标记的标准物的不同地标记的标准物。所述方法使用所述多个可分辨峰作为一系列 已知浓度的所述多种重同位素物标记的标准物而生成标准曲线。
[0016] -个【具体实施方式】是多种具有相同氨基酸序列的重同位素标记的肽标准物，所述 肽标准物各自包含重氨基酸的不同同位素物，并且各自具有相同标称质量和化学式但具有 13C-、15N-、ls0-、34S-或2H-的不同置换，以产生具有毫道尔顿质量亏损的肽标准物。所述重 同位素标记的肽标准物用于质谱分析中。
[0017] -个【具体实施方式】是多种具有相同氨基酸序列的重同位素标记的蛋白质标准物， 所述蛋白质标准物各自包含重氨基酸的不同同位素物，并且各自具有相同标称质量和化学 式但具有 13〇、1%-、180-、345-或％-的不同置换，以产生具有毫道尔顿质量亏损的肽标准物。 所述重同位素标记的蛋白质标准物用于质谱分析中以对给定靶蛋白质的每种肽进行定量。
[0018] 一个【具体实施方式】是一种对样品中的蛋白质、多肽或肽进行定量的试剂盒。所述 试剂盒包含多种具有相同氨基酸序列的重同位素标记的蛋白质和/或肽标准物，所述蛋白 质和/或肽标准物各自包含重氨基酸的不同同位素物，并且各自具有相同标称质量和化学 式但具有 13C-、15N-、ls0-、34S-或2H-的不同置换，以产生具有毫道尔顿质量亏损的肽标准物； 和使用所述试剂盒通过质谱对所述样品中的所述蛋白质、多肽或肽进行定量的说明书。所 述试剂盒可以具有在复用测定中使用所述标准物的说明书。所述试剂盒可以具有在诊断测 定中使用所述标准物的说明书。
[0019] -个【具体实施方式】是一种使用复用重肽内标物通过质谱在样品中进行绝对蛋白 质或肽定量的方法，所述重肽内标物使用受保护的氨基酸同位素物作为重同位素物前体用 于肽合成而制备。所述受保护的氨基酸同位素物可以包含芴基甲氧羰基（FMOC)保护的重 同位素物前体用于肽合成。所述方法可以进一步包括以所要比例混合重同位素物肽的集合 以用作复用内标物。将所述FMOC保护的氨基酸前体以确定比例混合，并且随后在单一反应 中合成肽同位素物混合物。芴基甲氧羰基（FMOC)保护的同位素物的混合物可以按确定比 例用于肽合成中。
[0020] -个【具体实施方式】是一种使用复用重蛋白质内标物通过质谱在样品中进行绝对 蛋白质或肽定量的方法，所述重蛋白质内标物使用氨基酸同位素物作为重同位素物前体用 于蛋白质合成而制备。所述方法可以进一步包括以所要比例混合重同位素物蛋白质的集合 以用作复用内标物。将所述氨基酸前体以确定比例混合，并且随后在单一反应中合成蛋白 质同位素物混合物。氨基酸同位素物的混合物可以按确定比例用于蛋白质合成中。
[0021] -个【具体实施方式】是一种使用标准曲线使用质谱分析对样品中的靶蛋白质或肽 进行绝对定量的方法，所述标准曲线在所述MS分析中对所述靶蛋白质或肽是特定的。所述 方法首先以低分辨率并且随后以高分辨率分辨复用内标蛋白质和/或肽同位素物。其可以 用于通用报告子测定。所述蛋白质或肽可以用于在全动态范围内诊断患者的医疗或生理状 况。
[0022] -个【具体实施方式】是一种使用质谱分析和用标准曲线对样品中的靶蛋白质或肽 进行绝对定量的方法，所述标准曲线在所述MS分析中对所述靶蛋白质或肽是特定的，所述 标准曲线由肽混合物生成，所述肽混合物用重氨基酸的不同同位素物合成，在所述蛋白质 或肽中产生至少ImDa的质量亏损。所述方法可以进一步包含获得单低分辨率MS峰，然后 获得多个高分辨率峰，和对每种同位素物的强度进行定量以使用所述标准曲线对所述样品 中的所述靶蛋白质或肽进行定量。
[0023] -个【具体实施方式】是一种使用质谱分析和用标准曲线对样品中的靶蛋白质或肽 进行绝对定量的方法，所述标准曲线在所述MS分析中对所述靶蛋白质或肽是特定的，所述 标准曲线由蛋白质混合物生成，所述蛋白质混合物用重氨基酸的不同同位素物合成，产生 至少ImDa的质量亏损，由蛋白水解消化产生所述蛋白质集合的肽。所述方法可以进一步包 含获得单低分辨率MS峰，然后获得多个高分辨率峰，和对每种同位素物的强度进行定量以 使用所述标准曲线对所述样品中的所述靶蛋白质或肽进行定量。
[0024] -个【具体实施方式】是一种通过质谱分析相对于AQUA蛋白质或肽定量的增强准确 度和/或灵敏度的方法，其使用多于一种肽同位素物，以生成含有用于每个测定的每种标 准物的多个浓度的内标曲线。所述方法可以进一步包含制备重靶肽的至少三个同位素物集 合，通过MS将重靶肽与轻靶肽分离，在低分辨率下比较所述重靶肽与轻靶肽的峰以测定所 述靶肽的浓度，和在高分辨率下分辨同位素物和基于所述内标曲线分析代表不同同位素物 浓度的每个峰。
[0025] -个【具体实施方式】是一种通过质谱分析相对于AQUA蛋白质或肽定量的增强准确 度和/或灵敏度的方法，其使用多于一种蛋白质同位素物，以生成含有每种标准物的多个 浓度的内标曲线，所述每种标准物针对天然蛋白质分析物的每种相应肽。所述方法可以进 一步包含制备重靶蛋白质的至少两个同位素物集合，通过MS将重靶肽与轻靶肽分离，在低 分辨率下比较所述重靶肽与轻靶肽的峰以测定所述靶肽的浓度，和在高分辨率下分辨同位 素物和基于所述内标曲线分析代表不同同位素物浓度的每个峰。
[0026] -个【具体实施方式】是一种基于质量亏损而生成质谱分析的标准曲线的方法。所述 方法包含制备氨基酸的多种同位素物以生成重肽标准物，以固定的所要比例混合所述多种 同位素物，用低分辨率MS或用高分辨率MS分离所述混合的同位素物，然后使用分离结果以 制备标准曲线。分离可以通过LC-MS进行，并且所述标准曲线可以用完整离子制备。分离 可以通过LC-MSn进行，并且所述标准曲线可以用碎片离子制备。所述方法可以用以验证所 述靶蛋白质或肽不含同量异位素干扰。
[0027] -个【具体实施方式】是一种基于质量亏损而生成质谱分析的标准曲线的方法。所述 方法包含制备氨基酸的多种同位素物以生成重肽标准物，以固定的所要比例混合所述多种 同位素物，用低分辨率MS或用高分辨率MS分离所述混合的同位素物，然后使用分离结果验 证MS校准。
[0028] -个【具体实施方式】是一种基于质量亏损而生成质谱分析的标准曲线的方法。所述 方法包含制备氨基酸的多种同位素物以生成重肽标准物，以固定的所要比例混合所述多种 同位素物，用低分辨率MS或用高分辨率MS分离所述混合的同位素物，然后使用分离结果验 证目标分析物的质量偏移。
[0029] -个【具体实施方式】是一种质谱分析定量方法，包含（a)制备多种蛋白质同位素 物，（b)制备重肽内标物，（c)将（a)和（b)加标（spiking)到目标样品中，（d)消化所述目 标样品（c)，（e)对由天然靶蛋白质分析物（c)和重蛋白质同位素物（a)消化得到的每种相 应轻：重肽进行定量，（f)通过MS分析分离所述肽，和（g)用所述重肽内标物（b)对所述 轻和重肽同位素物进行定量，以使用所述内标物和来自目标和内标蛋白质集合的所有相应 轻：重同位素物肽对来对所述目标分析物肽进行定量。
[0030] -个【具体实施方式】是一种质谱分析定量方法，包含（a)制备多种质量标签同位素 物，（b)制备用所述质量标签同位素物标记的肽内标物，（c)将（a)和（b)加标到目标样品 中，（d)消化所述目标样品（c)，（e)用所述标签的轻版本标记所述目标样品和所得通用报 告子肽，（f)通过MS分析分离所述肽，和（g)使用所述内标物对目标分析物进行定量。
【附图说明】
[0031] 图1展示使用内标物对蛋白质目标的质谱分析（MS)定量。
[0032] 图2展示两种同位素异构体（isotopomer，具有不同重同位素原子的化学异构体， 以便所述异构体具有相同单位质量但同位素元素不同）的低分辨率MS和高分辨率MS。
[0033] 图3展示不同浓度的三种不同同位素异构体在高MS分辨率下的标准曲线的生成。
[0034] 图4示意性地说明使用溶液中的或固定化在固体支持物上的前体氨基酸同位素 物（isotopologue)的确定混合物而合成内标物。
[0035] 图5展示赖氨酸+SDa同位素物与两种市售同位素物（填充黑色，来自赫伯特等人 2013)的可能重同位素组合和质量。
[0036] 图6展示赖氨酸+8Da同位素物与七种6毫道尔顿（mDa)间隔的代表性同位素物 (加框）的39种可能化学式和质量。
[0037] 图7a_b展示精氨酸+6Da同位素物与七种6mDa间隔的代表性同位素物（加框，图 7a)的37种可能化学式和质量，和精氨酸+IODa同位素物与七种6mDa间隔的代表性同位素 物（加框，图7b)的86种可能化学式和质量。
[0038] 图8展示九种代表性芴基甲氧羰基（FMOC)保护的氨基酸的化学结构，所述氨基酸 可以通过在加框区域中同位素标记而用作重同位素物前体用于肽合成。
[0039] 图9展示三嗪和嘌呤核心分子和相应胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺衍生物的化学 结构。
[0040] 图10a-b展示三嗪核心（图10a)的13种可能同位素物和嘌呤核心（图10b)与 六种6mDa间隔的代表性同位素物（加框）的15种可能同位素物。
[0041] 图11示意性地展示用于质谱定量的肽。
[0042] 图12示意性地展示待定量的肽键联到报告子肽并且关联到通用肽U的配置，所述 肽各自用一种或多种重氨基酸或重氨基酸同位素物标记。
[0043] 图13示意性地展示多于一种肽的定量的【具体实施方式】，每种肽键联到单独报告 子肽R，其中每种肽和报告子肽用重氨基酸或重氨基酸同位素物标记。
[0044] 图14示意性地展示三个串接重肽同位素物集合键联到单报告子肽R的具体实施 方式。
[0045] 图15示意性地展示使用单一测定（复用）同时测定样品中的多于一种分析物的
【具体实施方式】，其中三个蛋白质型肽同位素物集合各自可裂解地键联到其自身的报告子肽 R并且关联到单通用报告子肽Uplex同位素物集合。
[0046] 图16示意性地展示组分中间的配置和关系。
[0047] 图17示意性地展示肽组分中间的配置和关系。
[0048] 图18示意性地展示SEQ ID NO. 22-25的命名规则。
[0049] 图19示意性地展示靶向定量的天然分析物、键联到报告子肽并且关联到通用肽U 的对应于靶向分析物的内标（IS)肽的配置。将串接IS:报告子肽和通用肽各自用化学MS 标签的重同位素物集合标记，并且将加标有内标物的消化的样品用相同化学MS标签的轻 或特有同位素物版本标记。
[0050] 图20展示LVALVR(SEQ ID NO. 22)+IODa同位素物（图7b中加框）的模拟光谱， 与同位素物峰的放大展开图（插图）。
[0051] 图21a_c示意性地展示使用重氨基酸同位素物与体外蛋白质翻译试剂盒（图21a) 或与表达目的蛋白质并且生长于补充有重氨基酸同位素物的标准培养基中的培养细胞 (图21b)的混合物合成重蛋白质、接着提纯用作内标物的重蛋白质同位素物用于相对定量 (图21c)的方法。
[0052] 图22展示使用消化的重同位素物标记的蛋白质内标物对混合物中的天然蛋白质 目标的所有相应肽进行相对定量的配置。至少一种肽的独特重AQUA版本可以用于对重同 位素物标准物和靶蛋白质进行绝对定量。
[0053] 图23展示使用重蛋白质同位素物集合（1:4比例的13C6 15N2赖氨酸：2H8-赖氨酸用 于体外Aktl合成，#)对细胞裂解物中来自Aktl的天然肽SLLSGLLK(SEQ ID NO. 64)定量的 LC-MS 结果，其中有 IOOfmol 的双重 AQUA肽 13C615N-亮氨酸，13C6 15N2-赖氨酸，SLL*SGLLK* (SEQ ID NO. 64)加标到混合物中用于绝对定量。
[0054] 本发明的【具体实施方式】如下。
[0055] -种通过以下方式通过质谱（MS)对样品中的靶蛋白质或肽进行绝对定量的方 法：使用复用重肽内标物的至少一个集合制备内标同位素物，其中所述至少一个集合内的 每种肽含有相同氨基酸序列，但所述集合内的所述肽相差质量亏损而产生内标同位素物， 所述质量亏损通过在至少一个氨基酸分子内的不同原子上并入重同位素而产生；和使用所 述复用内标同位素物对至少一种靶蛋白质或肽进行定量。在一个【具体实施方式】中，每个集 合内的所述重肽内标物在每种肽内含有相同数目的总中子，但不同在于，所述氨基酸内的 重原子分布为每种肽所特有。在一个【具体实施方式】中，每个集合内的所述重肽内标物在低 分辨率质谱分析下分辨为单峰，并且在高分辨率质谱分析下分辨为多峰。在一个具体实施 方式中，每个集合内的所述重肽内标物在每种肽之间含有小于1道尔