一种人类免疫缺陷病毒ⅰ型p24抗体检测elisa试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人类免疫缺陷病毒I型P24抗体检测ELISA试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV)是艾滋病的病原体能 攻击人体免疫系统的病毒，它把人体免疫系统中最重要的T淋巴细胞作为主要攻击目标， 大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能。因此，人体易于感染各种疾病，并可发生恶性肿瘤， 病死率较高。由于其基因易突变，到目前为止还未有特效的防治疫苗，所以防治艾滋病仍是 以早发现缩小隐形感染传 播范围，早治疗防止病情进一步恶化。虽然自1983发现HIV病毒 以来，HIV病毒相关检测指标的研究一直没有停息过，研究从HIV抗体检测到p24抗原检测、 HIV核酸检测以及T淋巴细胞计数等检测项目。但目前在国内的初筛实验依然以HIV抗体 检测为主，窗口期较长容易漏检。目前HIV分为1型和2型，但是国内主要流行HIV-I，而在 HIV-I病毒中，gag基因所编码的结构蛋白是该病毒含量最丰富的蛋白，对于HIV-I颗粒的 组装及释放至关重要且相对稳定不易突变。gag基因全长表达产物P55经蛋白酶水解后成 为P24/P17/P15蛋白，而p24是HIV-I病毒颗粒的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程 中起重要作用。P24蛋白的氨基酸序列在HIV-I各毒株之间高度保守，缺失p24会导致病毒 无法正常组装。衣壳蛋白P24特异性很强，与多数其他逆转录病毒无交叉反应，并且HIV-I P24抗体出现较其他抗体早，所以可用于HIV-I感染的早期辅助诊断，但目前的HIV-I P24 抗体检测的试剂盒假阳性率高，特异性低，至今未能得到广泛应用。
【发明内容】
[0003] 针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种人类免疫缺陷 病毒I型P24抗体检测ELISA试剂盒，可有效解决现有ELISA检测HIV-I抗体的方法检测 窗口期长，易漏检及HIV-I P24抗体检测的试剂盒假阳性率高，特异性低的问题。
[0004] 本发明解决的技术方案是，该试剂盒内设有预包被HIV-I P24抗原酶标板，阴性对 照液血清、阳性对照液血清、辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体（即酶标二抗，购买于生 工生物工程有限公司）、抗体稀释液、显色剂TMB A液和显色剂TMB B液、终止液、洗涤液、 封板膜；其中，阴性对照液血清为正常人血清；阳性对照液血清为含HIV-I P24抗体的人血 清；HIV-I P24抗原为纯化的重组P24蛋白，P24蛋白由以下P24基因序列构成：
[0005] CN 105158465 A ^ 2/1U 贝
[0006] 所述的HIV-I P24抗原的制备方法是：选择HIV-I阳性样本，提取RNA反转录为 cDNA ;分别设计三轮引物，其中第一轮引物为：
[0007] gag_A_ 5, -TCTGGCTGTGTGCCCTTCTTTGCCACAATTGAAACACTT-3，
[0008] gag_S_ 5, -CGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAG-3，
[0009] 第二轮引物为：
[0010] P24_S1 :5' -AGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATG-3，
[0011] P24_A1 :5, -TTTGTTACTTGGCTCATTGCTTCAG-3'
[0012] 第三轮引物为：
[0013] P24_NC0 I -2 :5 ' -TTAACATGCCATGGGCCCTATAGTGCAAAACCT-3 '，其 5 ' 端设计有 NCO I酶切位点；
[0014] P24_XH0 I -2 :5'-AACCGCTCGAGTGGCAAGATTCTTGCTTTGT-3'，其 5' 端设计有 XHO I酶切位点；
[0015] 利用上述引物，扩增模板CDNA，扩增后片段大小为693bp，利用omega胶回收试剂 盒切胶回收，得切胶纯化的P24基因片段（P24 DNA)，扩增DH5a-PET32a菌株，得PET32a质 粒，将获得的PET32a质粒和切胶纯化的P24基因片段利用NCO I和XHO I分别双酶切， 酶切后的产物分别用omega胶回收试剂盒进行纯化回收，得酶切PET32a质粒和酶切P24 基因片段；酶切P24基因片段和酶切PET32a质粒连接，构建PET32a-P24重组质粒，提取 PET32a-P24质粒转入BL21菌株中，构成BL21-PET32a-P24菌株，通过IPTG诱导表达P24抗 原，利用镍柱填料初次纯化P24抗原后，再经SDS-PAGE电泳切胶回收再次纯化P24抗原，置 于磷酸盐缓冲液中，透析，经聚乙二醇8000浓缩得浓缩蛋白，即为纯化的重组P24蛋白；
[0016] 所述的预包被HIV-I P24抗原酶标板的制备方法是：
[0017] (1)将纯化的重组P24蛋白用碳酸盐包被液稀释至2ug/ml，得稀释液，每孔IOOul 稀释液包被96孔聚苯乙烯微孔板，封膜，4°C，16-18小时；
[0018] (2)微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS (即磷酸盐缓冲液）洗 涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板；
[0019] (3)封闭微孔板：在96孔聚苯乙烯微孔板的各个孔中加入200ul封闭液，封膜，置 于37°C水浴箱，2h ;
[0020] (4)微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS洗涤3次，拍干96孔 聚苯乙烯微孔板；
[0021] (5)预包板的保存：装封闭袋中，置于4°C保存备用；
[0022] 其中，碳酸盐包被液的配制：碳酸钠（Na2CO3) 0· 8g，碳酸氢钠（NaHCO3) I. 45g，加纯 水溶解后定容至500ml，调PH至9. 6,4°C保存；
[0023] PBS 的配制：氯化钠（NaCl)8g，氯化钾（KCl)O. 2g，ΚΗ2Ρ04(磷酸二氢钾）0· 24g， Na2HPO4 (磷酸氢二钠）I. 44g，纯水定容至1000ml，调PH至7. 2 ;
[0024] 封闭液的配制：含5%体积浓度的胎牛血清的PBS ;
[0025] 所述的检测人类免疫缺陷病毒I型P24抗体检测试剂盒的检测方法：
[0026] (1)实验设计：根据待测样本的数量选择相应的预包被HIV-I P24抗原酶标板的 微孔数量，另设空白对照、阴性对照、阳性对照各一孔；
[0027] (2)试剂配制：使用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体，抗体稀 释液和辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体的体积比为1:6000,即得酶标二抗工作液；
[0028] (3)加样：将待测样本用抗体稀释液按体积比1 :20稀释，每个待测样本的微孔中 待测样本加入量为50ul、阴性对照的微孔中阴性对照液血清加入量为50ul、阳性对照的微 孔中阳性对照液血清加入量为50ul，空白对照的微孔中不加样；
[0029] (4)温育：用封板膜封盖反应板，置于37°C水浴箱，温育Ih ;
[0030] (5)洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次， 最后在吸水纸上拍干；
[0031] (6)加酶：空白对照的微孔除外，其余每孔加入酶标二抗工作液50ul ;
[0032] (7)温育：用封板膜封盖反应板，置于37°C水浴箱，30min ;
[0033] (8)洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次， 最后在吸水纸上拍干；
[0034] (9)加底物液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照的 微孔内均加入显色剂TMB A液和显色剂TMB B液各50ul，震荡仪震荡混匀，置于37°C水浴 箱，温育15min ;
[0035] (10)加终止液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照 的微孔内均加入50ul终止液，震荡仪震荡混匀；
[0036] (11)检测：取波长450nm (参考波长630nm，建议使用双波长的酶标仪检测）设定 酶标仪检测，以空白对照的微孔校零，再读取各孔OD值；
[0037] (12)结果判断：阴性对照（A值）*2. 5 =临界值（cut off值），阴性对照高于0. 05 时按实际OD值算，阴性对照小于0. 05按0. 05计算，凡待测样本的A值大于临界值即为阳 性，反之，则为阳性；
[0038] 其中，抗体稀释液：100ml PBS中加入5ml胎牛血清和50ul Tween-20,调pH值至 7. 2 ;洗涤液：含0. 15% Tween-20的PBS，pH值为7. 2 ;显色剂TMB A、B液：购买于北京泰天 河生物技术有限公司；终止液：2mol/L H2SO4溶液；
[0039] 本发明利获取到新的HIV-I P24基因序列，并用此序列基因重组表达抗原蛋白包 被ELISA，经间接法检测样本HIV-I P24抗体，因为衣壳蛋白p24特异性很强，与多数其他逆 转录病毒无交叉反应，并且HIV-I P24抗体出现较其他抗体早，所以具有较高的特异性和敏 感性，有效用于HIV-I感染的早期辅助诊断。
【具体实施方式】
[0040] 以下结合实际情况对本发明【具体实施方式】作进一步详细说明；
[0041] 1、获取 HIV-I P24 基因
[0042] (1)获取经WB (免疫印记法）确证过的HIV-I阳性样本；利用Trizol法提取HIV-I P24 RNA模板，方法是，复苏液氮冻存的HIV-I阳性样本PBMC (单个核细胞），取HIV-I阳 性样本PBMC 500ul加 Iml Trizo