一种富硒益生菌中硒形态测定的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种针对富砸益生菌中砸形态的测定方法，属于砸的分析测试领域。
【背景技术】
[0002]砸是人体必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的必需成分，砸有抗氧化的作用，与人体健康息息相关，砸具有抗癌、保护心脏、抗肝坏死、防治近视和白内障、解毒、提高免疫力、延缓衰老和增强生殖功能等多种药理作用。据不完全统计，世界上有40多个国家和地区缺砸，而我国有72%的地区属于缺砸地区，因此，寻找和开发富砸产品，以保证人体摄入充足的砸，正被各国科学工作者关注。
[0003]乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌，能够将碳水化合物发酵成乳酸，因而得名，乳酸菌具有多种功效，能促进动物生长，调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能；提高食物消化率和生物效价；降低血清胆固醇，控制内毒素；抑制肠道内腐败菌生长:提高机体免疫力等。基于上述功效，乳酸菌目前被广泛应用于酸奶、饲料添加剂等各个领域。研究表明，乳酸菌对砸具有一定的富集效果，可利用砸进行营养强化，制成各种富砸乳酸菌产品，使其同时具备乳酸菌和砸的双重功效，发展前景广阔。
[0004]目前，通过液体发酵得到的富砸乳酸菌，大部分仅以总砸含量作为评价指标，而菌体内砸形态则不进行测定评价。而由于砸具有一定的毒性，有机砸比无机砸安全性更高，且更易被人体所吸收，故富含有机砸的乳酸菌才是人体所需要的。因此，有必要对富砸乳酸菌中的砸形态进行测定，弄清其砸形态的分布。目前，专门针对富砸乳酸菌中砸形态的测定方法尚未见报道，已有的砸形态测定方法主要针对植物、水产品、酵母等。“富砸大米中有机砸、蛋白砸、多糖砸或RNA砸含量测定方法”(专利申请号:201310135560.3)、微波消解-1CP-MS法直接测定海产品中有机砸、蛋白砸或多糖砸的检测方法”(专利号:ZL201210458397.1)等专利则采用对样品进行提取分离，将含砸的各组分分离后，然后利用ICP-MS上机测定各组分总砸含量，从而确定样品中的砸不同结合组分的含量。但该方法只能确定砸与何种生物大分子结合，而不能具体的得到各砸代氨基酸的种类；“一种砸的检测方法”(专利申请号:201310658482.5)介绍了利用HPLC-HG-AFS测定砸形态的方法，该方法通过测定样品中的总砸与无机砸含量，然后利用差减法得到样品有机砸的含量。该方法仅简单的利用总砸与无机砸的差值确定为有机砸含量，不仅结果不精确，而且也无法确定具体的有机砸为何种形式的砸；“从富砸酵母中提取含砸蛋白的方法”(专利申请号:201110440135.6)则介绍了一种利用pH值11~14的碱溶液对富砸酵母中含砸蛋白的提取的方法，但该法利用的强碱类溶液会对砸形态造成破坏，不利于砸形态的测定；“富砸植物材料中砸形态的测定方法”(专利申请号:201110428248.4)、“富砸食用菌中砸形态的测定方法”(专利申请号:201110428249.9)、“植物砸形态的检测方法”(专利申请号:201210215457.5)等专利介绍了植物类样品中砸形态的处理测定方法，这些方法采用对样品前处理后利用蛋白酶K和XIV进行酶解，将样品中各组分的砸温和的释放出来，然后利HPLC-HG-AFS或HPLC-1CP-MS上机测定砸形态。发明人利用上述方法对富砸益生菌进行砸形态测定后发现，形态提取率和仪器的检出率均很低，无法准确的得到富砸益生菌中砸形态分布，可能的原因是乳酸菌的属于细菌，其细胞结构与体内砸蛋白结构均与植物不同，利用测定植物砸形态的方法无法有效的对各形态的砸进行分离。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是:针对目前传统方法测定富砸益生菌时提取率不高或无法检出的问题，拟建立一种专门用于富砸益生菌中砸形态测定的方法。
[0006]本发明的富砸益生菌中砸形态测定的方法，包括如下步骤:
(1)样品的前处理:取经过研磨的富砸益生菌干样，加入缓冲液中，进行超声提取；
(2)样品破壁酶解:取步骤(I)经过前处理的样品，调节pH值至5-7，然后向其中加入溶菌酶，进行酶解；
(3)样品酶解:将步骤(2)破壁酶解后的样品的pH值调节至1.5-2.5，然后加入胃蛋白酶，进行酶解；
(4)样品分离后再酶解:将步骤(3)酶解后的样品进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测；将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入胰蛋白酶，然后进行酶解；
(5)样品分离:将步骤(4)经胰蛋白酶酶解后的样品进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测；
(6)上机测定:对步骤(4)和(5)中过水系膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法联用上机测定样品中的砸形态(包括:四价砸(Se4+)、六价砸(Se6+)、砸代胱氨酸(SeCys2)、砸代蛋氨酸(SeMet)、砸甲基砸代胱氨酸(SeMeCys ))。
[0007]优选地，步骤(I)中所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液，浓度为0.1-0.2mol/L0
[0008]优选地，步骤(I)中所述富砸益生菌与缓冲液的质量体积比为0.1-0.2g:5mL。
[0009]优选地，步骤(2)中溶菌酶与所述富砸益生菌的质量比为10~50:100~200，酶解温度为30-50°C，酶解时间为12~18h。
[0010]优选地，步骤(3)中胃蛋白酶与所述富砸益生菌的质量比为20~50:100~200，37°C恒温酶解18~24h。
[0011]优选地，步骤(4)中所述富砸益生菌与缓冲液的质量体积比为0.l~0.2g:5mL，胰蛋白酶与所述富砸益生菌的质量比为20~50:100~200，37°C恒温酶解18~24h。
[0012]本发明中所述富砸益生菌是指经过液体深层富砸发酵培养得到的富砸益生菌，总砸含量在10~1500 mg/kg。优选地，富砸益生菌为富砸嗜酸乳杆菌、富砸嗜热链球菌、富砸保加利亚乳杆菌或富砸双歧杆菌等。
[0013]相对于现有技术的方案，本发明的优点在于:
1)经过溶菌酶的处理，富砸益生菌的细胞壁被打开，细胞内的含砸蛋白等物质被释放至提取液中，有利于后续的提取过程；
2)酶解时离心管采用水平放置的方式，加大了比表面积，有助于酶促反应的发生；
3)本发明中酶促反应采用不同的酶对样品进行分步连续提取，排除不同酶之间的相互干扰，同时也将酶解后的酶解液与反应体系分离开，保证了酶解后样品中各游离形态砸的稳定性，同时也有利于下一步的酶促反应。
[0014]4)采用本发明对富砸益生菌样品进行测定，提取率达到50-80%，而采用传统的植物样品形态测定方法，直接利用蛋白酶K与蛋白酶XIV对样品进行酶解处理，其提取率不到20%，本发明在此基础上，将提取率最高可提高近4倍。
[0015]5 )本发明中各步骤反应条件温和，实验采用的超声提取前处理过程以及各步的酶解等步骤均不会改变样品体内的砸形态，不会导致砸形态变化，更能真实的反映样品内砸形态的分布。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0017]实施例1:富砸嗜酸乳杆菌样品砸形态测定实施例选用的富砸嗜酸乳杆菌总砸含量为1018 mg/kg (Dff)0
[0018]样品前处理:称取0.1g富砸嗜酸乳杆菌样品于15 ml离心管中，加入5 ml的0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，调节pH至5_7，然后向其中加入1mg的溶菌酶，然后将离心管水平放置于30°C恒温振荡摇床中培养12-18h。
[0019]样品酶解:将上述反应体系的pH值调节至1.5-2.5，然后加入20mg的胃蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中18-24h。
[0020]样品分离后再酶解:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm，离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入5ml缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入20mg的胰蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中18-24h。
[0021]样品分离:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000rpm，离心时间15-30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测。
[0022]上机测定:对上述两步骤中过膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法(hplc-hg-afs )联用上机测定样品中的砸形态。
[0023]实施效果:
经过形态测定分析，富砸嗜酸乳杆菌形态以砸代蛋氨酸(SeMet)为主，有机砸比例达到65%，砸形态提取率为54%。
[0024]实施例2:富砸嗜酸乳杆菌样品砸形态测定实施例选用的富砸嗜酸乳杆菌总砸含量为504mg/kg (Dff)0
[0025]样品前处理:称取0.2g富砸嗜酸乳杆菌样品于15 ml离心管中，加入5 ml的0.2mol/L的磷酸缓冲液，调节pH至5_7，然后向其中加入30mg的溶菌酶，然后将离心管水平放置于50°C恒温振荡摇床中培养12-18h。
[0026]样品酶解:将上述反应体系的pH值调节至1.5-2.5，然后加入45mg的胃蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中18-24h。
[0027]样品分离后再酶解:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm，离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入5ml缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入45mg的胰蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中18-24h。
[0028]样品分离:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000rpm，离心时间15-30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测。
[0029]上机测定:对上述两步骤中过膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法(hplc-hg-afs )联用上机测定样品中的砸形态。
[0030]实施效果:
经过形态测定分析，富砸嗜酸乳杆菌形态以砸代蛋氨酸(SeMet)为主，有机砸比例达到80%，砸形态提取率为65%。
[0031]实施例3:富砸嗜热链球菌样品砸形态测定实施例选用的富砸嗜热链球菌总砸含量为306 mg/kg (Dff)0
[0032]样品前处理:称取0.2g富砸嗜热链球菌样品于15 ml离心管中，加入5 ml的0.lmol/L的Tris-HCl缓冲液，调节pH至5_7，然后向其中加入50mg的溶菌酶，然后将离心管水平放置于40°C恒温振荡摇床中培养12-18h。
[0033]样品酶解: