基于金属离子特异响应的荧光检测法在免疫检测中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物免疫检测技术领域，具体地说，设及基于金属离子特异性响应的 巧光检测方法在免疫检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 本发明是利用各种金属离子巧光分子对金属离子的特异性响应W及巧光分子与 金属离子容易发生特异性反应从而引起自身巧光强度发生变化，并将运种变化应用于免疫 检测的技术。由于不同浓度的金属离子引起巧光强度的变化是不同的，因此，用巧光光谱仪 对相关巧光强度进行测量可实现免疫检测中的定量检测。
[0003] 巧光分子，因其具有最高可达单分子检测的高灵敏度，对亚微粒也具有可视的亚 纳米空间分辨能力和亚毫秒时间分辨能力，所W在原位检测（巧光成像技术）W及利用光纤 进行远距离检测等方面具有众多优势，已经发展成为一项重要的检测技术。在免疫检测方 面，人们将免疫反应的特异性与巧光物质的敏感性、直观性相结合开发出了一种新的免疫 检测技术一-免疫巧光技术（IFA)。目前，在免疫巧光技术中常用的巧光标记物有：有机染 料、半导体量子点阵及稀±离子配合物。相比较半导体量子点阵及稀±离子配合物，有机染 料具有制作简单、原料来源丰富、价格低的优点。但是，传统有机染料的分子由于具有对光 不稳定、背景巧光干扰强W及与生物分子的连接缺少共性等不足使其在应用上受到很大限 制。
[0004] 金属纳米粒子因为能够共价结合抗原和抗体，已被应用于抗原抗体的特异性检 测，运方面最典型的就是胶体金免疫检测技术。运一检测技术主要是利用纳米金的红色，通 过抗体与纳米金结合(金标抗体)，当抗原浓度较高时，金标抗体浓度也比较高，聚集产生红 色：表示是阳性反应。由于运一检测技术本身显色机理的原因，其灵敏度较低，不适合用于 检测低浓度的待测物，因此在应用上受到较大限制。而其他金属纳米粒子，如银纳米粒子、 氧化铜纳米粒子等在免疫检测中也一直没有得到应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于弥补传统免疫检测技术中的不足，将金属离子巧光检测方法与 金属纳米标记免疫技术相结合，采用金属纳米作为信号放大系统，利用磁珠作为抗原和抗 体的载体，提供一种基于金属离子特异响应的巧光检测法在免疫检测中应用的技术，它能 实现对测样品的快速分离，具有操作简便、检测快速、准确性好、检测成本低、灵敏度高的优 点，可在免疫分析检测及临床研究中发挥重要作用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取了W下技术方案。
[0007] -种基于金属离子特异响应的巧光检测法在免疫检测中的应用。
[0008] 进一步，所述巧光检测法为利用金属离子促使巧光分子结构发生改变，使所述巧 光分子产生一个从无到有的巧光变化，所述巧光变化的强度能通过巧光光谱仪直接判断和 测量。
[0009] 进一步，所述巧光分子含有金属纳米颗粒，所述金属纳米颗粒能通过化学反应产 生金属离子，所述金属离子与免疫检测中的反应物结合在一起能引起金属离子巧光强度发 生变化，且不同浓度金属离子引起的巧光强度的变化程度是不同的，用巧光光谱仪对巧光 强度的变化进行测量便能实现对待测样品的定量检测。
[0010] 进一步，在基于金属离子特异响应的巧光检测中采用磁珠作为抗原、抗体的载体。
[0011] 进一步，所述磁珠采用活化试剂进行活化，经活化后的磁珠能与抗原、抗体相结 合，进而实现对抗原和抗体的负载。
[0012] 进一步，所述活化试剂为采用戊二醒或者水溶性的碳二亚胺缩合剂。
[0013] 本发明的积极效果是： (1)将传统的金属离子巧光检测方法与金属纳米标记免疫技术相结合并应用于免疫检 测中，不仅解决了传统巧光分子与生物蛋白分子连接困难的问题，实现了对检测信号的有 效放大，而且避免了传统免疫试验中酶的使用，解决了酶催化反应对实验条件要求苛刻而 产生的问题。
[0014] (2)采用磁珠作为抗原、抗体的载体，实现了对待测样品的快速分离，使检测过程 更简便快速，使检测的准确性、灵敏度都有很大的提高。
[0015] (3)利用化学反应代替传统的酶催化过程并将所述巧光检测方法引入生物免疫检 巧。，缩短了反应时间，提高了体系的稳定性，降低了检测成本，可在免疫分析检测及临床研 究中发挥重要作用。
【附图说明】
[0016] 附图1为采用酶标板作为抗原、抗体的载体，基于银离子特异响应的巧光检测法 在免疫检测中的应用的流程图。
[0017] 附图2为采用磁珠作为抗原、抗体的载体，基于银离子特异响应的巧光检测法在 免疫检测中的应用的流程图。
[0018] 图中的标号分别为： 101、酶标板； 102、磁珠； 2、包被抗体； 3、抗原； 4、标记抗体； 5、银纳米颗粒； 6、银离子巧光分子。
【具体实施方式】
[0019] W下结合附图继续介绍本发明基于金属离子特异响应的巧光检测法在免疫检测 中的应用的【具体实施方式】。提供4个实施例。应当指出，本发明的实施不限于W下所述的 实施方式。
[0020] 实施例1 采用酶标板作为抗原、抗体的载体，基于银离子特异响应的巧光检测法在甲胎蛋白 (AFP)检测中的应用（参见图1 )，应用中，酶标板101可采用96孔酶标板、48孔酶标板或384 孔酶标板等不同孔数的酶标板，所述酶标板均包含可拆与不可拆两种型号，酶标板的颜色 包含黑色、白色W及无色透明色。所用包被抗体2为单克隆AFP抗体；所用抗原3采用AFP 抗原；所用银标抗体为用银纳米颗粒5标记的多克隆AFP标记抗体4 ;所用金属离子巧光分 子检测液为含有银离子巧光分子6的巧光检测液。
[0021] 首先，将包被抗体2吸附在酶标板101上。
[0022] 然后，将包被抗体2修饰的酶标板101与抗原3结合，并进一步与由标记抗体4与 银纳米颗粒5相连接而得到的银标抗体相连接。
[0023] 第三通过银纳米颗粒5与抗原3的对应关系，越多的抗原3能结合更多的银纳米 颗粒5,可通过银纳米颗粒5实现对抗原3的标记及信号的放大。
[0024] 最后，向标记好银纳米颗粒5的酶标板101中加入银离子巧光检测液(银离子巧光 分子6)，通过测试银离子巧光检测液的巧光强度能定量出体系中银纳米颗粒5的多少，实 现对抗原3的检测。
[0025] 其具体操作步骤如下(结合图1进行说明）： (1)采用酶标板101作为抗原、抗体的载体（内容同上)。
[0026] (2)制备银离子巧光检测液 ①采用化合物A作为银离子巧光分子；所述化合物A的结构式为：
式中Et=乙基。
[0027] 所述化合物A自身处于一种巧光关闭的状态，没有巧光；但是，当有银离子存在 时，银离子会与化合物A发生反应，致使化合物A的结构发生改变而转换成化合物B;化合 物B自身却有着很强的巧光，从而能实现一个巧光从无到有的变化：
式中Et=乙基。
[002引②银离子巧光检测液的配置 将银离子巧光分子6溶于乙醇与水的混合溶剂中（含20%乙醇)，构成混合溶剂并使银 离子巧光分子6的最终浓度保持在1~20iiM;向混合溶剂中分别加入双氧水与憐酸的水 溶液，保持溶液中双氧水和憐酸的最终浓度分别为10~lOOmM和1~20iiM;超声，使各成 分混合均匀；然后置于4°C条件下保存备用。
[0029] ③对制得的银离子巧光检测液的测试 取100yL银离子巧光分子溶液注入10yL的20~50yM硝酸银溶液，反应lOmin后， 用530~560nm可见光激发，可观察到明显的巧光产生，采用巧光分光光度仪测试，在585nm 处有强的巧光，即认为该银离子巧光检测液对银粒子有灵敏的响应，可应用于免疫检测。
[0030] (3 )制备银标抗体 ①将银纳米颗粒5与抗体结合，选择直径为5nm~200nm的银纳米颗粒5 :取lOmL的 1~20nM银纳米颗粒5溶液加入1~5yL5mg?血1的AFP多克隆抗体，将混合好的溶液 置于摇床上混合12~2地。（注：当银纳米颗粒5直径大于200皿时，加入双氧水，银离子 的溶出速度会比较缓慢，需要超过化，而且银离子很难完全溶出；当银纳米颗粒5直径小于 5nm时，银纳米颗粒5完全溶出所产生的银离子数小于1〇3,不足W达到所需的放大效果)。
[0031] ②向得到的银标抗体溶液中加入200yL1~5%牛血清白蛋白（BSA)对银纳米颗 粒5表面没有结合甲胎蛋白多克隆抗体的部分进行封闭，25°C摇床上混合12h，后置于4°C 条件下保存备用。
[0032] ③对制得的银标抗体的测试 I、经紫外可见吸收光谱表征，证明获得的是银标抗体。
[0033]II、经抗体活性测试，证明银标抗体保持了原有的抗体活性。
[0034] III、结论：制备的银标抗体可用于免疫检测。
[0035] 注：W上各步骤可一并做，也可W分开做，是为进行巧光检测的前序部分或者准备 部分。
[0036] (4)W甲胎蛋白（AFP)为例进行免疫检测 ①将AFP的单克隆包被抗体2溶于抑=9. 6的碳酸盐缓冲液中（4yg?mL1)，在酶标板 101的每个孔中加入100yL的上述溶液，4°C条件下过夜。
[0037] ②用憐酸盐吐溫缓冲液（PBST)清洗步骤①的酶标板101S至五次，加入100~ 400yL1%的牛血清白蛋白（BSA)封闭。
[0038] ③用憐酸盐吐溫缓冲液（PBST)清洗步骤②的酶标板101S至五次，加入不同浓度 的甲胎蛋白（AFP)，在37°C条件下解育1~化。
[0039] ④用憐酸盐吐溫缓冲液（PBST)清洗步骤③的酶标板101S至五次，加入100~ 200yL步骤（3)制备的银标抗体，在37°C条件下解育1~化。
[0040] ⑥用憐酸盐吐溫缓冲液（PBST)清洗步骤④的酶标板101S至五次，加入100yL步 骤（2)制备的银离子分子溶液，反应30min后，通过巧光光谱进行定量检测。
[0041] 检测实施例1中巧光强度的表征意义(检测原理） (1)当甲胎蛋白浓度较高时，结合相应量的银标抗体，加入双氧水腐蚀后产生较高浓度 的银离子，从而会促使较多的银离子巧光分子发生反应，检测液会产生较强的巧光。
[0042] (2)当甲胎蛋白浓度较低或者浓度为0时，产生的银离子浓度响应较低或者不产 生银离子，从而只有较少量的银离子分子发生反应或者没有银离子分子发生反应，银离子 巧光检测液的巧光强度也相对较弱或者是没有巧光。
[0043] (3)本发明能利用银标抗体在对甲胎蛋白（AFP)的检测中实现用巧光法检测甲胎 蛋白。但是，采用实施例1的方法容易产生较强的背景巧光干扰，从而影响检测的灵敏性