用于细菌监测的方法和设备的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及特别是通过使用光学监测，检测和测量样品中细菌污染的领域。
【背景技术】
[0002] 生物传感是工业中的重要领域，特别是在食品工业中，其中，检测和监测生物污染 物水平（如食品中的细菌水平）对于维持现代健康标准极为重要。在食品工业中，不断监 测从生产线掉落的产品的需要是特别重要和有问题的，因为任何造成产品的生物污染的生 产故障必须在产品被装运用于销售之前检测出来。目前，通常通过测试来自各条生产线和 批次的样品所生长的培养物来进行检测。但是，由于生长和测试这种培养物所需要的时间， 即使使用现代加速培养生长和测量技术，在检测到污染之前，可能已经有大量的产品被生 产和包装好以备装运了，从而导致相当大的损失。现有技术例如表面等离子体共振（SPR) 可以恒定地监测产品内生物污染物的水平，但这样的技术是昂贵的，通常的安装花费数万 美元。由于不同的生产线生产大量不同的产品，这种生物传感技术通常对于食品工业的普 遍使用而言过于昂贵，并且似乎不存在可以高成本效益广泛在线监测食品的低成本生物传 感设备。
[0003] 近年来，多孔硅（以下称为PSi)已成为有前景的用于生物传感应用以及用于以纳 米级尺寸传感其他祀的纳米材料。常见基于PSi的光学传感器和生物传感器由纳米孔隙 (通常尺寸小于20nm)或介孔（通常在20-100nm范围内）的薄膜组成，因此其横截面尺寸 比所使用的光波长小得多。通常，这些孔隙在薄膜装置的生产过程中随机地产生。这些传 感器的操作基于用靶分析物替换孔隙内的介质和/或用靶分析物渗透，并且观察光学反射 率所产生的变化。PSi膜的有效折射率的变化表现为反射谱的波长偏移。只有渗入这些纳 米结构的靶分子可以被检测到。事实上，已成功地证明诸如荧光分子、有机磷酸盐、挥发性 有机化合物、DNA和蛋白质的多种化学和生物分析物的传感和生物传感。许多这些研究采 用反射干涉傅立叶变换光谱法（RIFTS)来监测介孔硅薄膜内的生物相互作用。
[0004] 这种填充的或部分填充的、且随机定位的孔隙可以被视为简单地具有与未填充的 孔隙不同的有效折射率，因为孔隙比光波长小得多。因此，孔隙的随机性质不会导致光散 射，而是将来自娃基底与填充的和未填充的孔隙的组合的总反射光平均（averaging out)。 然而，这种检测方案不适用于靶向大生物或其他物质（species)，例如其尺寸为约数百纳米 至数微米及以上的那些，包括细胞、细菌和病毒。如果产生具有这种较大孔隙的多孔硅，基 底成为被称为"黑硅"的材料，其看上去如此，是因为它强烈地散射来自大尺寸孔隙的随机 分布的光。基本上所有的入射光都被孔隙随机地散射，并被吸收在介质中，使其不能被用于 传感。因此，现有技术的多孔硅技术不能被用于传感或生物传感较大尺寸的靶，所述尺寸是 用于传感的光波长的重要部分。
[0005] 存在替代方法，其不是在其孔隙内，而是在生物传感器表面的顶部直接捕获较大 的细胞靶之后即监测反射光谱强度的变化。然而，这些类型的传感器是有局限的，因为反射 光谱的强度变化可能有不可预测的来源，例如环境效应和非特异性结合事件。此外，因为这 样的表面结合传感器没有利用大的多孔体积，灵敏度可能较低。
[0006] 近年来，已经尝试开发新的用于快速检测一般细菌、尤其是致病菌的生物测定 (bioassay)和生物传感器。然而，尽管在该领域内取得了显著进步，但目前的技术缺乏"实 时"或在实验室环境之外检测微生物的能力。
[0007] 因此，对下述检测方法和设备存在迫切需求，所述检测方法和设备至少克服一些 现有技术的系统和方法的缺点，并且特别地，能够执行大生物污染物质水平的连续监测，所 述大生物污染物质例如活细胞、致病细菌、孢子和病毒，或者类似尺寸的其他物质，即通常 等于或大于可见光的波长的尺寸。
[0008] 在本说明书的这一部分和其他部分中提到的每种出版物的公开内容在此通过引 用以其整体并入本文。
【发明内容】
[0009] 本公开描述示例性的新方法和系统，其用于大靶的检测和浓度测量，所述大靶例 如细胞、细菌或病毒等形式的微生物，或其他大型特定生物或其他靶。
[0010] 本公开的方法和系统基于孔隙或微室内的靶成分的捕获，并且可以通过注意它们 的下列特性而简要地总结：
[0011] (a)这些靶被捕获在尺寸被选择以容纳预期靶的孔隙或微室内，并因此应该至少 与靶一样大。此外，微室或孔隙的表面可以被修饰或调整，以提高细胞对孔隙的捕获和附 着。例如，孔隙的表面化学、孔隙表面的粗糙度以及其湿润性（疏水性的或亲水性的）可以 根据待检测的靶细胞和细菌的特定类型进行调整。
[0012] (b)排列孔隙/室的顺序，使得入射到其上的光被散射或反射，但不是随机的，而 是形成一组衍射级（a set of diffraction orders)，例如光栅典型的衍射图案。在这种 情况下，背散射光所测量的零级衍射图案允许直接传感所述孔隙/微室的有效光学厚度 (EOT)。因此，预期衍射光的零级显示出干涉图案，其由孔隙的EOT确定。可以调整孔隙的 深度，以允许EOT的灵敏检测。
[0013] (c)通过使用孔隙中的介质的折射率的变化来指示孔隙内的靶细胞的存在，从而 实现传感。所述介质通常是用于维持靶细胞的液体或缓冲液，并且其折射率的变化改变进 入孔隙并从孔隙反射的光的EOT。
[0014] (d) -种特定的但并非唯一的方法，尤其是在EOT大于光的光波长（Ε0Τ> λ )的时 候特别可用的检测EOT的方法，是使用快速傅立叶变换分析，由此，反射光的光谱进行傅立 叶变换，以获得单一的强度峰，其位置表征所述EOT。
[0015] (e)用于实现上述设备和方法的特别方便的设置（arrangement)采用二维周期性 大孔硅阵列结构（MPSiAS)。多种制备技术可以被用于制备这样的MPSiAS基质，例如电化学 方法或采用反应离子蚀刻（RIE)的干法蚀刻法。然而，应当理解的是，这些方法和结构可以 被其他材料和平台应用，例如其他半导体、有机聚合物、凝胶、玻璃，甚至金属表面。
[0016] 现在，考虑上述特征的更多细节。由于靶的尺寸等于或大于常用光源（包括紫外、 可见光和近红外光谱范围）的波长，不能使用孔径大到足以容纳这些靶的现有技术的PSi 基底，因为，如前所述，由于大尺寸分布和孔隙的随机位置，含有这种大孔隙的无序装配的 基底上的入射光照射将导致随机散射光。在本公开的设备和方法中，使用孔隙或微结构的 二维（2D)有序阵列，在垂直于孔隙平面的方向照射。该结构克服了在尺寸大于用于测量的 光的波长的孔隙上光学测量中的现有技术的问题。这种结构是有效的层状相光栅，并且能 够以2D周期性大孔硅阵列结构（MPSiAS)的形式来方便地实现，其孔径被配置来适应靶的 尺寸。例如，如果待捕获的细菌细胞的典型尺寸是在0. 5-2 μm范围内，这些孔隙或微室的 尺寸可以被制备成在I-IOym的范围内，以容纳那些细胞。然后，这些结构被用作检测诸如 细菌细胞的革El的光学传感平台（optical sensing platform)。可以通过以下方法来制备 PSi光子晶体的这种周期性结构，其孔径尺寸与细菌细胞的尺寸相当：通过光刻法以及其 后的电化学阳极氧化过程（使用氢氟酸基溶液）或者诸如反应离子蚀刻（RIE)的干法蚀刻 技术，来将孔隙的图案蚀刻入标准的市售的硅晶片（silicon wafer)。这两种方法在半导体 工业中均是公知的，并且与标准的硅处理技术兼容。所得的PSi结构作为层状光栅或相光 栅，根据由物理光学确定的光栅周期与光波长之间的严格关系，其将反射光以不同的角度 散射为一组衍射级（a set of diffraction orders)。如果与孔隙表面垂直采集所述反射 光，只对零级衍射进行测定。这通常通过使用具有适当的f数的光学透镜以及用于传送入 射光并采集背散射的零级反射光的光纤来实现。在这种情况下，只有与孔隙深度相关联的 相位延迟有助于由背散射光所产生的干涉图案。这种干涉图案被用于所述孔隙的有效光学 厚度（EOT)的测量。
[0017] 在孔隙内的靶细胞的存在改变孔隙内的介质的折射率，从而改变层状光栅内的孔 隙的有效光学厚度（EOT)。填充有靶细胞的介孔的百分比越大，EOT的变化就越大。因此， EOT的测量使得能够发现宿主溶液内的靶细胞的浓度。通过用宽带光源照射MPSiAS层，可 以实时进行层状光栅的EOT的测量。待测波长范围内的反射光光谱是来自MPSiAS的顶面 的反射以及来自穿过孔隙并且从它们的底部表面