荧光纳米标准板的制备方法

文档序号:9451033阅读:523来源:国知局
荧光纳米标准板的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种荧光纳米标准板的制备方法,特别涉及一种用于表征超分辨荧光显微系统分辨率的荧光纳米标准板的制备方法。
【背景技术】
[0002]长期以来,光学显微成像技术在人类探索微观世界的过程中一直发挥着重要作用。然而,受阿贝衍射极限的约束,传统光学显微技术无法将生命科学研究带到纳米尺度。随着荧光显微成像学的不断发展和完善,使得突破衍射极限成为可能。近年来,涌现出了许多超分辨焚光显微技术,如单分子定位显微术(Single Molecule Localizat1nMicroscopy,SMLM)、结构光照明显微术(Structured Illuminat1n Microscopy, SIM)以及受激发射损耗显微术(Stimulated Emiss1n Deplet1n, STED)等。这些焚光显微成像技术将科学研究带入“纳米”领域,让人类能够“实时”观察活细胞内的分子运动规律,为疾病研究和药物研发带来革命性变化。与其他技术相比,STED基于共聚焦显微技术,通过把被激发的荧光物质限制在小于衍射极限的范围内来实现超高分辨率,成像速度快,可以观察活细胞内实时变化的过程。
[0003]分辨率是评价光学显微系统最重要的标准,不同于普通光学显微系统,超分辨荧光显微系统的分辨率并不能直接给出,而是需要借助测试标准板进行复杂的图像处理,与光学系统参数(如光源波长、强度等)、数据处理技术及荧光染料种类等因素密切相关,而这些都大大提高了对测试标准板的要求。因此,准确表征超分辨荧光显微系统的分辨率显得非常重要。但在现有技术中,标准板的结构及尺寸难以得到可重复性的精确加工,荧光线条的排列不够整齐,制造工艺复杂,无法实现批量化生产,而这种加工的难度主要是源自对标准板的结构设计还不够科学合理,一些工艺环节的排布上也未能做到尽善尽美。

【发明内容】

[0004]针对现有技术中存在的不足之处,本发明的目的在于提供一种荧光纳米标准板的制备方法,其通过对板材结构的重新设计和对工艺细节的重新设计,可用于超分辨荧光显微系统分辨率的测定,制备工艺简单,可重复使用,产品稳定性高,易于批量生产。
[0005]本发明采用的技术方案如下:
[0006]—种荧光纳米标准板的制备方法,包括:
[0007]步骤I)采用电子束蒸发法或磁控溅射法在基底层表面形成一层金属层;
[0008]步骤2)在所述金属层表面旋涂光刻胶层;利用电子束光刻法对光刻胶层等间距曝光,显影后形成等间距的光刻胶线条;
[0009]步骤3)将所述光刻胶线条浸泡于硅烷化试剂中进行表面硅烷化处理,在光刻胶线条表面形成硅烷层;
[0010]步骤4)将所述硅烷层浸泡于荧光染料溶液中反应30min以在所述硅烷层的表面修饰荧光染料层;用乙醇冲洗后,氮气吹干;
[0011]步骤5)在所述荧光染料层表面旋涂用于保护荧光染料的透明保护层。
[0012]优选的是,所述的荧光纳米标准板的制备方法,其中,所述基底层为硅或氮化硅。
[0013]优选的是,所述的荧光纳米标准板的制备方法,其中,所述基底层为硅。
[0014]优选的是,所述的荧光纳米标准板的制备方法,其中,所述金属层选自铬、钛、铝、金或其组合。
[0015]优选的是,所述的荧光纳米标准板的制备方法,其中,所述金属层为铬。
[0016]优选的是,所述的荧光纳米标准板的制备方法,其中,所述硅烷化试剂为3-氨丙基三乙甲氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷。
[0017]优选的是,所述的荧光纳米标准板的制备方法,其中,所述金属层的厚度为5?50nmo
[0018]优选的是,所述的荧光纳米标准板的制备方法,其中,所述光刻胶层的厚度为50 ?130nm。
[0019]优选的是,所述的荧光纳米标准板的制备方法,其中,所述透明保护层的厚度为30 ?10nm0
[0020]优选的是,所述的荧光纳米标准板的制备方法,其中,所述荧光染料为异硫氰酸荧光素或荧光蛋白ATTO 488。
[0021]本发明的有益效果是:本案提及的标准板的制备方法步骤少,工艺简单,反应条件温和无污染,工艺重现性好,通过对标准板结构的改进,使得其可用于超分辨荧光显微系统分辨率的精确测定;通过精确调整荧光纳米标准板的结构尺寸,实现荧光线条结构的整齐排列,直观地反应出系统的分辨能力;同时,这种结构的标准板能够实现批量制作,操作简易方便,可重复使用,稳定性高,分辨率高。
【附图说明】
[0022]图1为采用本发明所述的制备方法制得的荧光纳米标准板的结构示意图。
【具体实施方式】
[0023]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0024]参照图1,本案提出一实施例的荧光纳米标准板的制备方法,包括:
[0025]步骤I)采用电子束蒸发法或磁控溅射法在基底层I表面形成一层金属层2 ;
[0026]步骤2)在金属层2表面旋涂光刻胶层3 ;利用电子束光刻法对光刻胶层3等间距曝光,显影后形成等间距的光刻胶线条;
[0027]步骤3)将光刻胶线条浸泡于硅烷化试剂中进行表面硅烷化处理,形成硅烷层4 ;显影后的光刻胶线条为类石英(S12)结构,其表面具有丰富的羟基基团,可直接利用硅烷化试剂对线条结构表面进行硅烷化,使表面具有功能化基团。金属层表面没有利于硅烷化的羟基基团,所以可实现选择性修饰。
[0028]步骤4)将硅烷层4浸泡于荧光染料溶液中反应30min以在硅烷层4的表面修饰荧光染料层5 ;用乙醇冲洗后,氮气吹干;
[0029]步骤5)在荧光染料层5表面旋涂用于保护荧光染料的透明保护层6。透明保护层6为透明的高分子树脂材料,它的作用是保护荧光染料,它自身不会产生荧光。
[0030]在上述实施例中,基底层I优选为娃或氣化娃,最优选为娃。
[0031]在上述实施例中,金属层2优选选自铬、钛、铝、金或其组合,最优选为铬。
[0032]在上述实施例中,硅烷化试剂优选为3-氨丙基三乙甲氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基娃烧。
[0033]在上述实施例中,金属层2的厚度优选为5?50nm。研究发现,金属层2的厚度对标准板所测分辨率的精度有一定的影响,若超出优选的范围将导致分辨率精度偏离最优值。
[0034]在上述实施例中,光刻胶层3的厚度优选为50?130nm。研究发现,光刻胶层3的厚度对标准板所测分辨率的精度有一定的影响,若超出优选的范围将导致分辨率精度偏离最优值。
[0035]在上述实施例中,透明保护层6的厚度优选为30?lOOnm。研究发现,透明保护层6的厚度对标准板所测分辨率的精度有一定的影响,若超出优选的范围将导致分辨率精度偏离最优值。
[0036]在上述实施例中,荧光染料优选为异硫氰酸荧光素或荧光蛋白ATTO 488,最优选为异硫氰酸荧光素。异硫氰酸荧光素与此结构的标准板匹配度最好,两者配合协调,可使标准板获得最佳的分辨率测试精度。
[0037]尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
【主权项】
1.一种荧光纳米标准板的制备方法,包括: 步骤I)采用电子束蒸发法或磁控溅射法在基底层表面形成一层金属层; 步骤2)在所述金属层表面旋涂光刻胶层;利用电子束光刻法对光刻胶层等间距曝光,显影后形成等间距的光刻胶线条; 步骤3)将所述光刻胶线条浸泡于硅烷化试剂中进行表面硅烷化处理,在光刻胶线条表面形成硅烷层; 步骤4)将所述硅烷层浸泡于荧光染料溶液中反应30min以在所述硅烷层的表面修饰荧光染料层;用乙醇冲洗后,氮气吹干; 步骤5)在所述荧光染料层表面旋涂用于保护荧光染料的透明保护层。2.根据权利要求1所述的荧光纳米标准板的制备方法,其特征在于,所述基底层为硅或氮化硅。3.根据权利要求2所述的荧光纳米标准板的制备方法,其特征在于,所述基底层为硅。4.根据权利要求1所述的荧光纳米标准板的制备方法,其特征在于,所述金属层选自络、钛、招、金或其组合。5.根据权利要求4所述的荧光纳米标准板的制备方法,其特征在于,所述金属层为铬。6.根据权利要求1所述的荧光纳米标准板的制备方法,其特征在于,所述硅烷化试剂为3-氨丙基三乙甲氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷。7.根据权利要求1所述的荧光纳米标准板的制备方法,其特征在于,所述金属层的厚度为5?50nm。8.根据权利要求1所述的荧光纳米标准板的制备方法,其特征在于,所述光刻胶层的厚度为50?130nm。9.根据权利要求1所述的荧光纳米标准板的制备方法,其特征在于,所述透明保护层的厚度为30?10nm010.根据权利要求1所述的荧光纳米标准板的制备方法,其特征在于,所述荧光染料为异硫氰酸荧光素或荧光蛋白ATTO 488。
【专利摘要】本案涉及荧光纳米标准板的制备方法,包括:1)采用电子束蒸发法或磁控溅射法在基底层表面形成金属层;2)在金属层表面旋涂光刻胶层;利用电子束光刻法对光刻胶层等间距曝光,显影后形成等间距的光刻胶线条;3)将光刻胶线条浸泡于硅烷化试剂中进行表面硅烷化处理,形成硅烷层;4)将硅烷层浸泡于荧光染料溶液中反应30min以在硅烷层的表面修饰荧光染料层;5)在荧光染料层表面旋涂透明保护层。本制备方法步骤少,工艺简单,反应条件温和无污染,工艺重现性好;通过精确调整荧光纳米标准板的结构尺寸,实现荧光线条结构的整齐排列,直观地反应出系统的分辨能力;同时,这种结构的标准板能够实现批量制作,稳定性高,分辨率高。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105203508
【申请号】CN201510551458
【发明人】蒋克明, 黎海文, 周武平, 张涛, 刘聪
【申请人】中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月1日
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