检测叶酸靶蛋白用检测体系及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测叶酸靶蛋白用检测体系及其检测方法，特别是一种基于磁性石墨烯对样本富集分离和以双链DNA为模板合成铜纳米颗粒实现信号放大相结合的检测靶蛋白用检测体系及其检测方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质一直是生命科学研究的重点，研究蛋白质的生理功能对促进生命科学的发展具有重要意义。生物传感由于其操作简便快速且仪器成本相对较低的优势，成为了蛋白质研究中具有重要地位的分析技术之一。虽然特定的代表蛋白可以通过抗体、适体甚至小分子作为识别元件来实现检测，但其检测的灵敏度有可能受到不利影响，限制了传感器的实际应用。例如，样本或者检测缓冲中存在潜在的干扰物质会增加检测的背景信号，单标记探针产生的检测信号较弱等，都可大大降低蛋白质检测的灵敏度。因此，开发靶分子富集技术和信号放大技术对提高传感器的灵敏度有重要意义。
[0003]纳米材料因其具有独特的电学、光学、机械性和磁性性能已被广泛使用。近年来，以石墨烯为平台建立的生物传感器在生物学研究中引起关注，尤其是磁性石墨烯的应用。磁性石墨烯是Fe3O4磁性纳米粒子和石墨烯的复合物，具有良好的水溶性、电子传递性以及机械性能和热力学性能，且可以呈现出磁性纳米Fe3O4的磁性分离性能和石墨烯吸附富集的优势。此外，因为单链DNA(ssDNA)可以借助其表面碱基通过疏水作用和π - π作用吸附在石墨烯的表面，所以拥有大尺寸二维芳香平面的石墨烯可以作为修饰特定生物分子的基底对样本富集分离。另一方面，铜纳米颗粒也是近年广被关注与研究的纳米材料，Cu2+被抗坏血酸还原后形成Cu原子，Cu原子在双链DNA模版上团聚而形成铜纳米颗粒。在酸性条件下合成的铜纳米颗粒又被还原成铜离子游离到溶液中，并通过溶解氧进一步催化邻苯二胺(OPD)的氧化以产生电活性2，3- 二氨基吩嗪(DAP)。
[0004]目前，叶酸结合蛋白的检测技术主要有质谱、亲和层析、动力学毛细管电泳、荧光共振能量转移和酶互补片段免疫分析等。但是这些检测技术有的需要昂贵的仪器，操作复杂，有的耗时费力，灵敏度低，均难以满足日常快速分析的要求。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种基于铜纳米颗粒和磁性氧化石墨烯的检测叶酸靶蛋白用检测体系及其检测方法。
[0006]本发明是采用电化学技术对蛋白质的特异性和灵敏性的检测。为实现以上目的，本发明所采用的机理如下:当叶酸结合蛋白不存在时，与叶酸标记的Probe链杂交的cDNA会被Exo III酶从3’末端开始逐步水解成单核苷酸，而在无双链DNA模板的情况下铜纳米颗粒不能合成，因而不能引起电化学响应。当叶酸结合蛋白存在时，叶酸标记的Probe链通过叶酸和叶酸受体的特异性作用连接上叶酸结合蛋白产生明显的位阻效应，从而保护cDNA链不被Exo III水解。此时，以双链DNA为模板可以合成铜纳米颗粒。铜纳米颗粒覆盖的核酸链可以通过Probe链的3’突出末端与磁性石墨烯结合，并在磁场作用下与反应溶液分离。之后，石墨烯表面的铜纳米颗粒被硝酸氧化为铜离子。经过磁场分离石墨烯固体后，溶液中的铜离子催化邻苯二胺(OPD)氧化为电活性的2，3_ 二氨基吩嗪(DAP)，产生显著的电化学信号放大效果。因此，通过电化学信号的灵敏变化就能够检测到很低浓度的叶酸受体，参见图1。
[0007]根据上述机理，本发明采用如下技术方案:
一种检测叶酸靶蛋白用检测体系，其特征在于每100 yL该传感体系含有70 uLMops-Buffer、25 μ L 4XExo III BufTer、l uL 10 uM 的 Probe 链和 I uL 10 uM 该链的互补cDNA链，在90 °C?95 °C的恒温下加热5?10 min，冷却至室温；所述的Probe链为:5’-folate-NH-GCGTCACATGGCTAGGGTAAAGTCTACGGCCGGGTAGA-3’ ；
所述的互补 cDNA 链为:5’ -CTAGCCATGTG ACGC -3’。
[0008]上述的检测叶酸革E蛋白用检测体系，其特征在于所述的Mops-Buffer为:20 mMMOPS、30 mM NaCl，pH 7.5。
[0009]上述的检测叶酸革E蛋白用检测体系，其特征在于所述的4XExo III Buffer为:20 mM Tris-HCU 3 mM MgCl2、50 mM NaCl，pH 7.4。
[0010]一种叶酸靶蛋白的检测方法，采用上述的检测叶酸靶蛋白用检测体系，其特征在于该方法的具体步骤为:
a.在每100μ L上述检测体系中，加入I μ L待测溶液，于37 °C温度下恒温1.5 h，然后，加入 0.1 unit/μ L Exo III 在 37°C下酶切 30 min，升至 80 °C灭活 10 min ;
b.在每100μ L步骤a所得溶液中加入I μ L、100 mM的抗坏血酸，震动混匀后加入50 μ L、200 μ M的无水硫酸铜到混合液，室温反应15 min,以在双链DNA表面形成铜纳米颗粒；
c.取磁性氧化石墨烯的二甲基亚砜溶液加入到步骤c所得溶液体系中，使该溶液体系中氧化石墨稀的浓度为100 μ g/mL，震摇20 min,使步骤b所得双链DNA吸附在磁性氧化石墨烯上，之后将该吸附有双链DNA的磁性氧化石墨烯与反应溶液分离；
d.将步骤c所得磁性氧化石墨烯浸没在0.5 M的硝酸中，然后将该磁性氧化石墨烯从溶液中分离；
e.在步骤d所得溶液与浓度为Img/mL的邻苯二胺OPD溶液按1:1.5?2的体积比混合，80 °C恒温反应10 min，然后利用电化学工作站并用差分脉冲伏安法测定分析电活性物质的信号变化，实现了叶酸受体在溶液中的检测。
[0011]本发明利用磁性氧化石墨烯对样本的富集分离特性，借助以DNA双链为模板合成铜纳米颗粒产生的信号放大的高度灵敏性，实现了对蛋白质的灵敏检测。本发明以叶酸作为代表研究了其与叶酸受体蛋白之间的相互作用，理论上可以推广对其他类型的小分子与靶蛋白相互作用进行检测。由于叶酸受体蛋白本身是一种肿瘤标志物，该方法还可以用于肿瘤标志物的检测，对肿瘤的临床监测提供技术支持，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0012]图1为本发明的方法原理图。
[0013]图2为在双链DNA无酶切、单链DNA无酶切、双链DNA加酶切、叶酸结合蛋白存在条件下双链加酶切等四种情况下电化学信号的脉冲差分伏安图。
[0014]图3为不同浓度的叶酸受体蛋白存在情况下得到的电化学信号变化图。
[0015]图4为叶酸受体蛋白浓度和电化学信号峰值之间的关系图。其中内嵌图为蛋白质浓度在0.01 ng/mL到100 ng/mL范围内与电化学信号变化值之间的线性关系图。
[0016]图5为不同种类的蛋白存在条件下获得的电化学信号变化图。
[0017]图6为血清检测浓度与实际浓度对照的统计表。
【具体实施方式】
[0018]实施例一:双链DNA为模板合成铜纳米颗粒流程
a.配制 100 μ L 的反应体系，其中加入 Mops-Buffer 70 yL、4XExo III Buffer 25μ L、10 uM的Probe链I μ L和10 uM的cDNA链I μ L混成均匀的溶液，放置于90 °C的恒温金属浴加热10 min后，自然冷却至室温，DNA双链发生杂交反应I h。在Probe链和cDNA链已发生杂交反应的溶液中，取10 μ L叶酸结合蛋白加入到反应液中，使之终浓度分别为 0、0.01 ng/mL、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、I ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、300 ng/mL 和 500 ng/mL，置于 37 °0|?温金属浴中 1.5 h，叶酸结合蛋白将识别并结合修饰在Probe链上5’端的叶酸分子。然后，加入I μ L ExoIII在37°C下酶切30 min，升至80 °C灭活10 min。