乳制品中糠氨酸的测定方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于食品添加剂的检测领域，具体涉及一种乳制品中糠氨酸的测定方法。【背景技术】
[0002] 牛奶对我国居民营养健康的贡献正处于快速增长期，到2004年全国人均奶占有 量达18. 8kg，但近一个时期，一些企业使用复原乳生产加工液态奶，在产品标识上误导消费 者，严重损害了广大消费者和农牧民的合法权益，造成了行业内的不公平竞争，扰乱了行业 秩序，影响了我国奶业健康发展。复原乳因受高温处理及长时间干燥贮存，其蛋白质结构紧 密，与鲜奶比降低了吸收率和营养成分。因此，为保护生产者的合法经营和消费者的正当权 益，区分生鲜乳和UHT灭菌乳中是否掺入复原乳具有重要意义。
[0003] 生鲜乳中掺入复原乳及其检测方法，国外从20世纪80年代就有报道。例如，利 用复原乳的荧光特性（Jenness，1984)、乳清蛋白热变性程度（Burton，1984)，牛乳中可溶 性核苷酸（Gil等1982)、牛乳中脱氧核糖核酸酶与核糖核酸酶活性（Cantafora等，1979) 等方法进行测定。但上述方法在应用上存在很多困难，主要受乳成分之间差异和杀菌方法 (温度和时间）不同而影响。
[0004] 牛乳在加热过程中会发生美拉德反应，使蛋白质和糖生成特定产物一一糠氨酸 (e -N-2-呋喃甲基-L-赖氨酸）。糠氨酸作为巴氏杀菌乳中复原乳成分的标示物质，可鉴 定巴氏杀菌乳中是否掺入复原乳。所以我们可以通过测定糠氨酸的含量来判断灭菌乳中是 否含有复原乳。通常国家规定超高温灭菌乳中的糠氨酸的含量190mg/100g(蛋白质）即判 定为复原乳。生乳中糠氨酸含量应低于7mg/100g ;乳粉中糠氨酸含量大于135mg/100g ;不 含复原乳的巴氏杀菌乳中糠氨酸含量应小于12mg/100g。使用高效液相色谱（HPLC)紫外检 测糠氨酸平均偏差5% (n = 5);回收率为98. 2%。
[0005] 在对样品品质检验过程中，往往要对样品进行前处理，根据处理得到的样品纯度 情况，再采用高效液相色谱、色谱-质谱/质谱联用等仪器进行检测。但由于这类仪器对 样品的纯度要求较高，进而对样品的前处理的要求也较高。常规情况下，一般采用高温、高 压的条件，去除样品处理过程中残留的盐类等物质。复原乳中糠氨酸的测定要经过水解、 干过滤和预萃取、HPLC分析等多个过程，该方法检测耗费时间长、检测限高、干扰大、回收率 低。乳制品中糠氨酸测定，常规方法是将样品置于耐热试管中，加入盐酸溶液，通入高纯度 氮气，再置于干燥箱中，在120°C下加热水解23h~24h，冷却后干过滤、稀释、过萃取小柱净 化，再接着应用高效液相进行检测。
【发明内容】
[0006] 为了克服上述技术缺陷，本发明提供了一种乳制品中糠氨酸的测定方法，前处理 节省时间，极大提高回收率，检测采用串联质谱，提高了特异性和灵敏度。
[0007] 本发明的乳制品中的糠氨酸的测定方法，包括如下步骤：（1)试样制备；(2)净化； (3)液相色谱-串联质谱联用；所述步骤（1)按如下方法操作：
[0008] 吸取2. OOmL试样，置于带密闭的耐热试管，加入6mL的11. 9mol/L浓盐酸，混匀； 向试管中缓慢通入高纯度氮气lmin~2min，密闭试管，然后将其置于干燥箱中，在115°C下 加热水解4h;刚加热约lh后，轻轻摇动试管；加热结束后，将试管从干燥箱中取出，冷却后 干过滤，保留滤液供测定。
[0009] 所述步骤（2)按如下方法操作：0. 10ml上清液于吹氮管，使用氮吹浓缩仪吹干后， 用甲酸-甲酸铵缓冲溶液定容至1. 〇〇ml，充分摇匀后用lmL注射器过滤膜转移至进样瓶，液 相色谱串联质谱测定。
[0010] 所述步骤⑶的测定条件如下：色谱条件：
[0011] a)色谱柱：ABEclipseXDB-C18(粒径 5^111，4.6\15〇111111)，或相当者；
[0012] b)进样量：5 y L ;
[0013] c)柱温：23°C ;
[0014] d)流速：0? 5mL/min ；
[0015] e)流动相：水92%，甲醇5%，甲酸-甲酸铵缓冲溶液3% ;
[0016] f)洗脱条件：平衡5min,等度洗脱lOmin ;
[0017] 质谱条件：
[0018] a)离子化方式：电喷雾电离；
[0019] b)扫描方式：正离子扫描；
[0020] c)检测方式：多反应监测（MRM);
[0021] 使用的雾化气、气帘气、辅助气和碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质 谱灵敏度达到检测要求。
[0022] 本发明可检测的乳制品包括生乳、复原乳、巴氏杀菌乳或超高温瞬时杀菌乳。本发 明的方法，前处理时间缩短，极大提高回收率，检测采用串联质谱，提高了特异性和灵敏度。
【附图说明】
[0023] 图1是标准品的多反应监测（MRM)离子色谱图；
[0024] 图2是糠氨酸的线性回归曲线及方程；
[0025] 图3是液体乳的高效液相PDA谱图。
【具体实施方式】
[0026] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。
[0027]1、实施方式中用到的仪器和设备如下：
[0028] (1)液相色谱-质谱/质谱联用仪：API4000Q TRAP (AB SCIEX公司，美国）。
[0029] (2)电子天平：精确到0? 01mg，0844cf0173-l (华南国家计量测试中心广东省计量 科学研究院）。
[0030] (3)氮吹浓缩仪：Turbo Vap@LV(Biotage公司，瑞典）。
[0031] (4)干燥箱：〇844cf0〇72 (Binder 公司，德国）。
[0032] (5)移液枪：5mL，1000 y L，100 y L，TransrcrpcUcK S (Brand 公司，德国）。
[0033] (6)带螺盖耐热试管或者其他能够密封的耐热试管：20mL。
[0034] (7)注射器：lmL、2mL。
[0035] 2、实施方式中用到的试剂与溶液如下：
[0036] 所用试剂纯度如下所示，水为去离子水。
[0037] (1)甲醇：色谱纯。
[0038] (2)糠氨酸（呋喃素，e-N-2-呋喃甲基-L-赖氨酸标准品）：购自上海安谱实验 科技股份有限公司，纯度为99. 3 %，结构为
[0039]
[0040] ⑶甲酸：多洲.0%。
[0041] (4)盐酸：优级纯。
[0042] (5)甲酸铵：多 99. 0%。
[0043] (6)高纯度氮气：99. 99%。
[0044] (7) 20mmol/L甲酸溶液：量取上述（3)中甲酸0? 38mL，加水定容至500mL，摇匀备 用。
[0045] (8) 20mmol/L甲酸铵溶液：准确称取0? 6306g上述（5)中描述的甲酸铵溶解于适 量水中，定容至500mL，混匀后备用。
[0046] (9) 610. 00mg/L糠氨酸的标准储备溶液：准确称取上述（2)中描述的糠氨酸标准 品6. 10mg，溶于水中，完全溶解后定容至25ml，低温保存，保存期半年。
[0047] (10)糠氨酸的标准工作液：用水逐级稀释上述（9)中描述的标准储备溶液，分 另ll 配制成 10. 〇〇mg/L、5. 00mg/L、2. 00mg/L、l. 00mg/L、0. 50mg/L、0. 20mg/L、0. 10mg/L 和 0. 05mg/L各级标准工作溶液，保存期3个月。
[0048] (11)甲酸-甲酸铵缓冲溶液：将20mmol/L上述（7)中描述的甲酸溶液和20mmol/ L(8)中描述的甲酸铵溶液按照8 :1的体积比混合成缓冲溶液，pH为3左右。
[0049] 实施例1 :本发明检测方法的一个优选实施例
[0050] 选择生乳、复原乳、巴氏杀菌乳和超高温（UHT)瞬时杀菌乳四种样品进行检测。 其中生乳是从健康奶畜挤下的常乳，仅经过冷却，可能经过过滤，但未经过巴氏杀菌、低于 巴氏杀菌的热处理、净乳和其他的杀菌处理；复原乳是炼乳或X和全脂乳粉与水勾兑成 的原料乳；巴氏杀菌乳是经低温长时间保持（62°C~65°C，保持30min)或经高温短时间 (72°C~76°C，保持15s ;或80°C~85°C，保持10~15s)处理得到的；超高温（UHT)瞬时杀 菌乳是经135°C以上保持数秒处理的。
[0051] (1)试样制备
[0052] 用移液枪吸取2. OOmL试样，置于带密闭的耐热试管，加入6mL的11. 9mol/L浓盐 酸，混匀。向试管中缓慢通入高纯度氮气lmin~2min，密闭试管，然后将其置于干燥箱中， 在115°C下加热水解4h。加热约lh后，轻轻摇动试管。加热结束后，将试管从干燥箱中取 出，充分冷却后干过滤，保留滤液供测定。在抽样和制样的过程中，必须防止样品受到污染 或发生残留物含量的变化。
[0053] (2)净化
[0054] 用移液枪取0. 10ml上清液于吹氮管，使用氮吹浓缩仪吹干后，用甲酸-甲酸铵缓 冲溶液定容至1. 〇〇ml，充分摇匀后用lmL注射器过滤膜转移至进样瓶，液相色谱串联质谱 测定。
[0055] (3)仪器参数及测定条件
[0056] 色谱条件：
[0057] a)色谱柱：AB Eclipse XDB-C18(粒径 5^111，4.6\15〇111111)，或相当者；
[0058] b)进样量：5 y L ;
[0059] c)柱温：23°C ;
[0060] d)流速：0? 5mL/min ；
[0061 ] e)流动相：水92%，甲醇5%，甲酸-甲酸铵缓冲溶液3% ;
[0062] f)洗脱条件：平衡5min，等度洗脱lOmin。
[0063] 质谱条件：
[0064] a)离子化方式：电喷雾电离；
[0065] b)扫描方式：正离子扫描；
[0066] c)检测方式：多反应监测（MRM);
[0067] 雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏 度达到检测要求