一种苦参碱的快速检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于快速热解-气相色谱-质谱联用技术（PY-GC/MS法）快速检 测苦参碱含量的方法。
【背景技术】
[0002] 苦参碱是豆科植物苦参、苦豆子、广豆根等中草药的活性成分，这一类生物碱还包 括氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱、槐醇碱、槐胺碱、氧化槐果碱等，其结构均属四环的喹诺里 西啶生物碱。大量研究表明，它们在肿瘤防治方面具有较好的应用前景，如复方苦参注射液 (岩舒）、氧化苦参碱（博尔泰力）、苦参碱注射液（斯巴德康）、康艾注射液等均已在临床 应用，特别是用于肿瘤的治疗。现代药理学研究表明，苦参碱和氧化苦参碱能抑制肿瘤细胞 增殖、诱导周期阻滞、促进细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、抗肿瘤新生血管形成以及抑制肿 瘤侵袭和转移等。同时，苦参碱也能逆转肿瘤的多药耐药性，并能增强临床上常用抗肿瘤化 疗药物的抗肿瘤活性。
[0003] 此外，最近的研究表明苦参碱在中枢神经系统疾病、心血管疾病、消化道系统疾病 中均有较好的预防和治疗作用。如，可增加小鼠脑中的抑制性递质的氨基丁酸和甘氨酸而 呈现镇静作用，也可明显抑制小鼠扭体痛反应，延长热刺激所致小鼠出现痛反应的潜伏期， 从而具有镇痛作用。周斌等人发现，苦参碱一方面能显著降低大鼠实验性高脂血症的血清 甘油三酯，降低血液黏度，改善血液流变学各项指标；另一方面，其能抑制纤维蛋白、纤维蛋 白原降解产物的作用，表现在能显著抑制大鼠主动脉内皮细胞释放乳酸脱氢酶及平滑肌细 胞的增殖，减少小鼠腹腔巨噬细胞分泌白细胞介素。因此苦参碱在防治动脉粥样硬化方面 亦具有一定的意义。因此，快速、高效检测中药或其复方制剂中的苦参碱对中药的质量控制 和进一步的现代化应用是非常重要的。现有对苦参碱的分析检测主要采用高效液相色谱 或高效液相色谱质谱联用的方法。受分析方法的要求限制，往往需要对样品进行较为复杂 的前处理，通过萃取等方法将苦参碱从中药材或其复方制剂中分离，随后采用HPLC/UPLC/ SFCLC等液相色谱方法分析；如果需要使用HPLC-MS分析方法，还需要对样品进行除盐的处 理。该类分析方法的样品处理过程复杂、总体分析时间长。
[0004] 快速热解-气相色谱/质谱联用技术（PY-GC/MS)是一种高效的检测易挥发性成 分的技术，近年来发展迅速。低温下的热解过程是一种非常有效的热分离手段，通过控制 热解的温度和时间可以实现低沸点的复杂混合物的初步的气-液或气-固相分离；为气相 色谱提供一种在线的和实时的样品前处理和初步分离能力。分析检测过程中的热解时间、 温度、升温速率、载气流速、分流比、离子化温度等对分析结果的影响是很大的。因此，基于 PY-GC/MS技术的特点，目前亟需提出一种针对苦参碱的快速、微量检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种苦参碱的快速检测方法，并基于此，初步判断苦参等 中药材及其制剂质量的高低。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0007] 1)准确称取苦参或其复方制剂0. 02~5.OOmg得样品，将样品加入热解杯中；
[0008] 2)采用快速热解-气相色谱-质谱联用仪对加入热解杯中的样品进行测定；
[0009] 3)经过步骤2)后，根据测定的原始色谱数据及质谱数据，定性样品中苦参碱的色 谱峰，并获得样品中苦参碱的相对含量。
[0010] 所述样品为块状或粉末状固体。
[0011] 所述热解的条件为：热解温度为180~450°C，热解时间为0. 1~lmin。
[0012] 所述气相色谱的工作条件为：载气为流速0. 1~4. OmL/min的氦气，分流比为0~ 500 :1，升温程序为：初始温度为40~70°C，并保持0~3min，然后以彡20°C /min升至 300 °C〇
[0013] 所述质谱的工作条件为：采用EI源、正离子检测，电子能量为50~85eV，离子源 温度为215~245°C，单四级杆温度为145~185°C，扫描方式为全扫描方式，电子倍增器电 压为1075~2980V，溶剂延迟为0~6min。
[0014] 所述相对含量采用面积归一化方法进行计算。
[0015] 所述苦参碱的色谱峰的定性采用NIST08软件自动匹配计算。
[0016] 本发明的有益效果体现在：
[0017] 1)快速分离。现有方法是将苦参或其制剂通过萃取方法初步分离得到苦参碱溶 液，过滤处理后，利用液相色谱分析，或薄层层析_光谱联用技术（TLC-SP)等检测其有效成 分；该方法的一般分析时间为4~24小时。本发明中通过热分离方法直接对苦参或其制剂 的低沸点物质进行初步分离，随后采用气相色谱进一步分离苦参碱，大大节省了分析时间， 常规分析时间为〇. 1~〇. 3小时，提高了分析效率。
[0018] 2)灵敏度好，所需样品量少。HPLC检测方法受到仪器的限制，一般需要先分离得 到粗品溶液，因此需要的样品量较大，通常是几克到几十克不等；本发明方法的分析所用样 品量一般为〇. 02~lmg，提高了分析灵敏度。
[0019] 3)本发明优化了热解、色谱、质谱等检测条件，可以快速定性所需的色谱峰，实现 了快速和准确检测。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0021] 本发明针对苦参碱的物化特点，采用快速热解-气相色谱/质谱联用技术（PY-GC/ MS)，充分将热分离和色谱分离相结合，实现苦参碱的快速分离，随后采用质谱定性和定量 检测，达到快速、微量检测的目的。
[0022] 实施例
[0023] -种基于PY-GC/MS检测苦参碱的方法，以中药材苦参为例，但本发明的保护范围 不局限于该实施例，具体步骤如下：
[0024] -、样品准备
[0025] 将取得的苦参（陕西天之润生物科技有限公司，西安）准确称取 1. 00mg(±0. 02mg)放入50 y L的热解小杯中；
[0026] 二、热解：
[0027] 热裂解炉采用 Frontiers 的 PY2020is ;
[0028] ①热解温度：260°C ;
[0029] ②热解时间：0? 3〇min。
[0030] 三、分离、检测
[0031] 色谱：
[0032] 气相色谱采用安捷伦7890A :
[0033] ①分析柱是HP-5MS弹性石英毛细管柱（30m*0. 25id*0. 25 y m);
[0034] ②载气：高纯氦气，流速为1. OmL/min ;
[0035] ③进样方式为分流进样，分流比为80 :1 ;
[0036] ④进样口温度为280 °C，传输线温度为290 °C ;
[0037] ⑤程序升温：初始温度为60°C，保持2min，然后以20°C /min升至300°C。
[0038] 质谱（采用安捷伦5975C):
[0039] ①EI源，正离子检测，电子能量为70eV ;
[0040] ②离子源温度为230°C，单四级杆温度为150°C ;
[0041] ③扫描方式为全扫描方式；
[0042] ④电子倍增器电压为2440V，溶剂延迟为3. 5min。
[0043] 四、数据分析及处理
[0044] 色谱图的保留时间和积分面积由工作站自动完成，利用NIST08谱库定性色谱峰。 各挥发性成分的相对含量通过面积归一化法得到。
[0045] 本样品苦参热解组分中可辨认的峰为27个，成分及其保留时间列于表1。保留时 间及峰面积用安捷伦Chemstation计算，相对含量用面积归一化的方法计算。
[0046] 表1?苦参中挥发性成分的组成和含量（tr= 15. 144 :苦参碱）
[0047]
[0048]
[0049] 五、精密度、重现性及稳定性实验
[0050] 1.精密度实验：以取自同一苦参的样品5份，按照上述方法连续进样5次，对相对 峰面积大于0. 5%的27个色谱峰进行分析，其相对保留时间和相对峰面积的RSD (相对标准 偏差）分别在3. 15~4. 55%和2. 23~4. 73%之间，说明本发明方法精密度良好。
[0051] 2.重现性实验：取同一批次苦参的样品5份，按照上述方法连续进样5次。结果 27个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在2. 16~4. 5%和2. 38~4. 09%之 间，说明本发明方法重现性良好。
[0052] 3.稳定性实验：取制备好的样品1份，分别在0、2、4、8、12、24h进样测定，结果27 个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于4. 87%，说明本发明方法在24h内测 定是稳定的。
[0053] 中药材因产地、季节、炮制方式的不同，其含水量、密度等都有细微的不同，继而其 复方制剂中的含量也有所不同。因此，需要的热解、分离和分析条件均不相同，据此得出本 发明中的条件范围。
[0054] 本发明具有操作简单，检测限低，实验重现性好，实验数据直观可靠等特点，特别 适用于微量样品检测（样品量可低至20 y g)，可用于对不同样品间的质量差别进行定量的 比较，应用性广，为该类中药材的质量标准和现代化应用提供了一条参考的思路和方法。
【主权项】
1. 一种苦参碱的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 准确称取苦参或其复方制剂0. 02~5.OOmg得样品，将样品加入热解杯中； 2) 采用快速热解-气相色谱-质谱联用仪对加入热解杯中的样品进行测定； 3) 经过步骤2)后，根据测定的原始色谱数据及质谱数据，定性样品中苦参碱的色谱 峰，并获得样品中苦参碱的相对含量。2. 根据权利要求1所述一种苦参碱的快速检测方法，其特征在于：所述样品为块状或 粉末状固体。3. 根据权利要求1所述一种苦参碱的快速检测方法，其特征在于：所述热解的条件为： 热解温度为180~450°C，热解时间为0. 1~lmin。4. 根据权利要求1所述一种苦参碱的快速检测方法，其特征在于：所述气相色谱的工 作条件为：载气为流速〇. 1~4.OmL/min的氦气，分流比为0~500 :1，升温程序为：初始温 度为40~70°C，并保持0~3min，然后以彡20°C/min升至300°C。5. 根据权利要求1所述一种苦参碱的快速检测方法，其特征在于：所述质谱的工作条 件为：采用EI源、正离子检测，电子能量为50~85eV，离子源温度为215~245°C，单四级 杆温度为145~185°C，扫描方式为全扫描方式，电子倍增器电压为1075~2980V，溶剂延 迟为0~6min。6. 根据权利要求1所述一种苦参碱的快速检测方法，其特征在于：所述相对含量采用 面积归一化方法进行计算。7. 根据权利要求1所述一种苦参碱的快速检测方法，其特征在于：所述苦参碱的色谱 峰的定性采用NIST08软件自动匹配计算。
【专利摘要】本发明提供一种苦参碱的快速检测方法：1)样品的准备；2)PY-GC/MS检测；3)数据分析及定性和定量分析。本发明选择PY-GC/MS技术对苦参碱含量进行检测，是针对苦参等以苦参碱为主要活性成分的中药材，因产地、季节、炮制等不同而品质不同的问题，提供一种苦参碱快速、微量的检测方法，进而初步判断此类中药材的质量，本发明具有操作简单，检测限低，实验重现性好，实验数据直观可靠等特点，特别适用于微量样品检测，可用于对不同产地、品种、批次的苦参等样品间的质量差别进行初步的比较，应用性广。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105203662
【申请号】CN201510600822
【发明人】龚频
【申请人】陕西科技大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月18日