基于磁性分离和量子点标记的卡他莫拉菌快速检测方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种基于磁性分离和量子点标记的检测卡 他莫拉菌（Moraxella catarrhalis，Mc)抗原的快速检测方法及检测试剂盒，以及该检测试 剂盒的制备及使用方法。
【背景技术】
[0002] 卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis，Me)首次发现于1896年，当时称之为卡他 微球菌（Micrococcus catarrhalis)，尔后又称为卡他奈瑟菌（Neisseria catarrhalis)和 卡他布兰汉菌（Branhamella catarrhalis)。卡他莫拉菌为革兰氏阴性球菌，通常呈肾形 双球菌状，偶可呈四联状，无鞭毛，无芽胞，一般无荚膜。其营养要求不高，普通培养基上即 可生长，需氧，最适生长温度为35°C。菌落直径1~3_，光滑型，灰白色，不透明，整个菌落 易从培养基上刮下。较长时间培养后，菌落可呈粗糙颗粒状，黏附在培养基表面。产氧化酶 和DNA酶。对糖类均不发酵。抵抗力较强，在痰中可存活27d，65°C时可存活30min。
[0003] 过去一直认为Me是对人体无致病性的上呼吸道正常寄居菌，但是，近20多年的研 究发现，该菌不仅可以引起儿童和老年人的上呼吸道感染，而且还是引起成人下呼吸道感 染的重要病原菌，是儿童上颌窦炎、中耳炎、肺炎以及成人的慢性下呼吸道感染的第3位最 常见致病菌，仅次于肺炎支原体和肺炎链球菌。已有报道该菌可引起呼吸道医院感染爆发 流行。因此，卡他莫拉菌及其所致感染日益受到人们关注，对该菌的生物学特性、流行病学、 所致疾病、耐药性以及感染的防治有了更多的认识。
[0004] 临床上由于Me与其他呼吸道病原体引起的感染症状类似，因此常难以根据临床 表现、x-射线检查等得出结论，确诊往往依赖于实验室诊断。而儿童疾病的特点是起病急、 转归快，因此敏感、快速、实用的Me检测对及早进行有效的临床干预具有非常重要的意义。
[0005] 尽管Me在全球范围内传播，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种类极少。 目前，Me感染的诊断方法有血清学检测法，核酸检测法和病原体直接检测法。
[0006]检测血清中Me IgG、IgA、IgM抗体常用的方法有：微量免疫荧光抗体检测（MIF)， 补体结合试验（CF)，重组酶免疫测定（rEIA)，血清补体结合一酶免疫测定试验（SeroCF- EIA)等。然而Me抗体的检出只能说明该个体感染过Me，却不能反映体内是否仍有Me活菌 存在，并且血清学特异性抗体检测常需要根据IgM抗体的动态结果进行判断，需要较长的 时间。同时，这些技术均存在灵敏度低、操作步骤复杂、需要专业人员操作、重复性差、检测 时间长、检测特异性差、成本较高等缺陷，因而难以满足临床的实际需要。
[0007] 核酸检测包括核酸杂交和聚合酶链式反应（PCR)，核酸杂交检测Me的特异性强， 但敏感性不高，主要用于PCR结果的检测、判定，尚未直接用于临床标本的检测；PCR具有较 高的敏感性，但PCR实验对实验室有特殊要求，标本处理、扩增和检测要求严格，且易出现 假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。
[0008] 病原体检测方法主要为病原分离培养法，将标本接种于血平板，35~37°C，于含 5%二氧化碳（C02)孵箱中孵育16~20h，再根据菌落形态、革兰染色及生化鉴定（氧化酶 阳性、葡萄糖阴性，DNA酶、硝酸盐还原酶阳性）确定为卡他莫拉菌。该法为检测卡他莫拉 菌感染的"金标准"，但其存在操作步骤复杂，检测时间长等明显缺陷，并不十分适合临床应 用。
[0009]因此，目前建立具高灵敏度、高特异性的卡他莫拉菌抗原快速检测法以满足临床 的检测需求就显得非常必要了。
【发明内容】
[0010] 针对【背景技术】中存在的这些技术问题，本发明提供了一种基于磁性分离和量子点 标记的能简便、快速、高灵敏度的检测卡他莫拉菌抗原的检测方法和试剂盒，以及该试剂盒 的制备及使用方法。
[0011] 本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0012] -种基于磁性分离和量子点标记的检测卡他莫拉菌抗原的方法，其特征在于：所 述该方法包括以下步骤：
[0013] 1)兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体的制备；
[0014] 2)鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体的制备；
[0015] 3)将步骤1)制备得到的兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体与纳米磁珠通过 共价偶联，制备抗卡他莫拉菌免疫纳米磁珠；
[0016] 4)将步骤2)制备得到的鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体与纳米量子点通 过共价偶联，制备量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针；
[0017] 5)取人呼吸道分泌物样本（包括但不限于咽拭子），用PBST缓冲液溶解后，加入 步骤3)制备得到的抗卡他莫拉菌免疫纳米磁珠，充分混合，反应15-45min后进行磁分离， 以PBST缓冲液洗涤2遍后，向磁分离得到的沉淀物中加入步骤4)制备得到的量子点标记 的抗卡他莫拉菌纳米探针，反应15_45min后进行磁分离，以PBST缓冲液洗涤2遍后，使 用荧光酶标仪读取荧光值；所述PBST缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0. 2g/LKC1， 0? 24g/LKH2P04,1. 44g/LNa2HP04,0. 5ml/LTween-20,所述PBST缓冲液的pH= 7. 4 ;
[0018] 6)根据步骤1)-步骤5)的方法分别检测四份经临床确定为卡他莫拉菌阴性的人 群的呼吸道分泌物样品，读取荧光值；所述卡他莫拉菌阴性的人群的呼吸道分泌物样品简 称卡他莫拉菌阴性对照样品；所述四份卡他莫拉菌阴性对照样品的荧光值的平均值与3倍 标准差之和即为⑶T-0FF值；若步骤5)中人呼吸道分泌物样本的检测荧光值大于⑶T-0FF 值，则判断为人呼吸道分泌物样本中卡他莫拉菌抗原为阳性；若步骤5)中人呼吸道分泌物 样本的检测荧光值小于CUT-OFF值，则判断为人呼吸道分泌物样本中卡他莫拉菌抗原为阴 性。
[0019] -种基于磁性分离和量子点标记的检测卡他莫拉菌抗原的试剂盒，其特征在于： 所述基于磁性分离和量子点标记的检测卡他莫拉菌抗原的试剂盒由具有富集卡他莫拉菌 抗原功能的抗卡他莫拉菌免疫纳米磁珠、量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针、质控品以 及PBST缓冲液所组成；所述质控品包括阳性质控品以及阴性质控品；所述阳性质控品由灭 活的卡他莫拉菌干燥结合到拭子上而成；所述阴性质控品是经临床确定为卡他莫拉菌阴性 的人群的咽拭子。
[0020] 一种用于制备基于磁性分离和量子点标记的检测卡他莫拉菌抗原的试剂盒的方 法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤 ：
[0021] 1)抗卡他莫拉菌免疫纳米磁珠的制备：
[0022] 1. 1)兔及鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG的制备
[0023] 1. 1. 1)重组UspAl-His融合蛋白的制备、纯化：
[0024] 1. 1. 1. 1)对卡他莫拉菌表面蛋白UspAl进行生物信息学分析，获取其胞外结构域 中抗原表位最为丰富的肽段；
[0025] 1. 1. 1. 2)找到步骤1. 1. 1. 1)中所得到肽段对应的基因编码序列，并在序列的5' 端及3'端引入酶切位点并化学合成全基因序列，同时标记记为UspAl;其基因序列如序列 表所示；
[0026] 1. 1. 1. 3)将步骤1. 1. 1. 2)中所得到的UspAl按分子生物学方法克隆入表达载体 pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组UspAl-His融合蛋白；所述重组UspAl-His融合蛋 白以包涵体表达方式存在于菌体中；
[0027] 1. 1. 1. 4)用镍柱纯化步骤1. 1. 1. 3)所得到的重组蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后， 以Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度为0. 2mg/mL后备用；
[0028] 1. 1. 2)兔及鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG的制备：
[0029] 1. 1. 2. 1)以步骤1. 1. 1. 4)中所得到的重组UspAl-His融合蛋白为完全抗原，分 别免疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白抗血清及鼠抗卡他莫拉 菌UspAl蛋白抗血清；所述兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白抗血清及鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋 白抗血清的间接ELISA效价均大于1X105 ;
[0030] 1. 1. 2. 2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白抗血清 及鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG;
[0031] 1. 1. 2. 3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1. 1. 2. 2)所得到的二种 多克隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为lmg/mL后备用；
[0032] 1. 2)免疫纳米磁珠的包被：
[0033] 1. 2. 1)取5mg磁珠，用1mlMES缓冲液洗涤三次，置于纳米磁分离器中进行磁分离 后移除上清；所述磁珠是以超顺磁性Fe304为内核、粒径为180nm的羧基磁珠；所述MES缓 冲液是质量浓度是2g/L的2-(N-吗啉代）乙磺酸；所述MES缓冲液的pH= 6. 0 ;所述纳米 磁分离器的磁性强度是〇. 4T;
[0034] 1. 2. 2)依次加入用步骤1. 2. 1)中的MES缓冲液配制的浓度是8-12mg/ml的EDC 溶液以及用步骤1. 2. 1)中的MES缓冲液配制的浓度是6-10mg/ml的sulfo-NHS溶液各 0. 5ml，以10-40rpm/min于旋转混合仪中活化lhr，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除 上清，用lml步骤1. 2. 1)中的MES缓冲液重悬，得到活化后的磁珠；
[0035] 1. 2. 3)取5个离心管，在每个离心管中加入200iiL步骤1. 2. 2)所得到的活化后 的磁珠，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，向各离心管中加入用PBS缓冲液稀 释的浓度为50-200iig/ml的由步骤1. 1)所制备的兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体 IgG溶液各lml，室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2-6h，置于纳米磁分离器中进行 磁分离后移除上清后，各加入lml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液，室温下以15rpm/min 于旋转混合仪中反应2h以封闭磁珠上未与抗体反应的羧基；所述PBS缓冲液中各成分含量 如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,所述PBS缓冲液的pH= 7.4；
[0036] 1. 2. 4)封闭反应完成后，将该5个离心管置于纳米磁分离器中进行磁分离后移 除上清，各用lml洗涤缓冲液洗涤三遍；所述洗涤缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,0.5ml/LTween-20,所述洗涤缓冲液的pH= 7.4 ；
[0037] 1. 2. 5)向各个离心管中分别加入lml保存缓冲液重悬磁珠，置于4°C保存备 用；所述保存缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/L Na2HP04,0. 3g/LNaN3,5g/L牛血清白蛋白（BSA)，所述保存缓冲液的pH= 7. 4 ;
[0038] 2)量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针的制备：
[0039] 其具体制备方法包括：
[0040] 2. 1)向微量离心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子点、300nmolN-羟基琥珀酰 亚胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亚胺EDC，以磷酸盐缓冲液定