一种重金属定量检测系统以及定量检测重金属的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重金属定量检测系统以及定量检测重金属的方法。
【背景技术】
[0002] 随着我国经济的快速发展和生活水平的提高，人们再对食品安全有了更高的要求 同时，由于我国在市场经济建设过程中由于制度建设和监管水平等多种原因导致我国食品 安全问题日益严重。引起食品安全问题的原因很多，重金属超标问题是影响食品安全的重 要因素之一。目前，重金属如铜、铅、锌、铁、钴、镍、锰、镉、汞、钨、钼、金、银等。现阶段对我 们人类和环境造成危害的重金属有以下几种元素：汞、镉、铅、铬、铜以及类金属砷等生物毒 性显著的重金属元素。
[0003] 如果重金属元素未经处理就直接排入河流、湖泊或海洋，或者进入土壤中，由于 它们不能被生物降解而使这些河流、湖泊、海洋和土壤受到污染。在食物链的生物放大作用 下，它们成千百倍地富集，最后进入人体。如鱼类或贝类积累的重金属被人类所食，或重 金属被稻谷、小麦等农作物吸收后被人类食用，重金属就会进入人体，使人产生重金属中 毒，轻则发生怪病（水俣病、骨痛病等），重则导致死亡。其次，重金属在人体内能和蛋白 质及酶等发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可在人体的某些器官中累积，造成慢 性中毒，重金属超标引起的中毒事件不胜枚举。对于水体和土壤中的重金属污染，现在还 没有很好的办法，因为存在于水和土壤中的重金属很难降解，并且还具有富集性，所以重金 属的污染是不可逆转的。
[0004] (1)铅：是可在人体和动物组织中积蓄的有毒金属。它是通过皮肤、消化道、呼吸 道进入体内与多种器官亲和，主要毒性效应是贫血症、神经机能失调和肾损伤，易受害的人 群有儿童、老人、免疫力低下人群。
[0005] (2)镉：不是人体的必需元素，可通过食物链富集作用危害人类健康，对人体多系 统具有毒性作用，联合国粮农组织和世界卫生组织将Cd2+列为第三位优先研究的食品污 染物。镉的毒性很大，可在人体内积蓄，主要积蓄在肾脏，引起泌尿系统的功能变化；镉能够 取代骨中钙，使骨骼严重软化，骨头寸断，会引起胃脏功能失调，干扰人体和生物体内锌的 酶系统，导致高血压症上升。易受害的人群是矿业工作者、免疫力低下人群。
[0006] (3)汞：萊及其化合物属于剧毒物质，可在人体内蓄积。血液中的金属汞进入脑组 织后，逐渐在脑组织中积累，达到一定的量时就会对脑组织造成损害，另外一部分汞离子转 移到肾脏。进入水体的无机汞离子可转变为毒性更大的有机汞，由食物链进入人体，引起全 身中毒作用；易受害的人群有女性，尤其是准妈妈、嗜好海鲜人士；天然水中含汞极少，一 般不超过0? 1yg/L。
[0007] (4)砷：是人体的非必需元素，元素砷的毒性极低，而砷的化合物。均有剧毒，三价 砷化合物比其它砷化合物毒性更强。砷通过呼吸道、消化道和皮肤接触进入人体，如摄入量 超过排泄量，砷就会在人体的肝、肾、肺、脾、子宫、胎盘、骨胳、肌肉等部位蓄积，与细胞中的 酶系统结合，使酶的生物作用受到抑制失去活性，特别是在毛发、指甲中蓄积，从而引起慢 性砷中毒，潜伏期可达几年甚至几十年，慢性砷中毒有消化系统症状、神经系统症状和皮肤 病变等。砷还有致癌作用，能引起皮肤癌。地面水中含砷量因水源和地理条件不同而有很 大差异，淡水平均为0. 5ym/L，海水为3. 7ym/L。
[0008] (5)铬：如误食饮用，可致腹部不适及腹泻等中毒症状，引起过敏性皮炎或湿疹， 呼吸进入，对呼吸道有刺激和腐蚀作用，引起咽炎、支气管炎等。水污染严重地区居民，经常 接触或过量摄入者。易得鼻炎、结核病、腹泻、支气管炎、皮炎等
[0009] (5)铜：过量铜在人体内富集，会出现恶心、呕吐、上腹疼痛、急性溶血和肾小管变 形等中毒现象，严重者还可导致急性肾衰等危害。铜粉尘可引起咽痛、咳嗽和咯痰，甚至 胸闷气憋，发冷发烧。
[0010] 目前常规重金属检测方法有原子荧光光度法（AFS)、电感藕合等离子体质谱 (ICP-MS)分析技术、电感藕合等离体原子发射光谱（ICP-AES)、高效液相色谱法等。在当前 众多应用于重金属离子检测的分析技术中，原子吸收光谱法是最常用的方法，该方法通常 有较高的灵敏度，但成本较高、需要专业技术人员操作、获得较高的灵敏度需要较大的样本 容量且由于样本必须依次分析而耗时较长。因此，不能满足当前大批量样品快速，简便和适 于现场检测的需求。
[0011] 免疫分析法是一种具有高度特异性和灵敏度的分析方法，重金属检测主要有有 间接竞争性ELISA法和胶体金快速免疫层析法。采用免疫层析法检测时，需要用胶体金显 色。
[0012] 胶体金是由氯金酸（HAuC14)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用 下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的 疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。
[0013] 免疫分析法利用抗原抗体特异性结合反应，使标记抗体的显色剂显色，而检测各 种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与 抗体的正电荷基团结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响抗体的生物特性。因而利用 胶体金进行免疫分析时，具有方便快捷不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点，得到 广泛使用。
[0014] 然而，由于胶体金只有在弱碱性环境下才能与抗体有效结合，一旦检测对象的pH 不是弱碱性的，则无法准确检测，而重金属的检测需要用强酸提取，虽然通过增加稀释倍数 的方式可以勉强检测，但是检测结果不准确。
[0015] 中国专利申请CN201010229009. 1公开了一种重金属汞抗体制备及酶联免疫吸附 法测定重金属含量的方法，可以用来检测重金汞，但是该方法准确性查，而且操作复杂，需 要专业大型设备。中国专利申请CN201020521531. 2公开了一种重金检测卡，该检测卡只能 再特殊环境中进行检测，而且只能定性检测，无法定量检测是。
[0016] 因此市面上需要一种能够快速、准确定量检测重金属，而且方便携带的检测系统。
【发明内容】
[0017] 本发明的目的在于提供一种重金属定量检测系统。
[0018] 首先，本发明提供了一种改性胶体金的制备方法，它包括如下步骤：
[0019] (1)取直径为10~60nm的胶体金溶液100份，加入胶体金溶液体积的0? 1~3% 的二（三乙醇胺）钛酸二异丙酯溶液，二（三乙醇胺）钛酸二异丙酯溶液的浓度为1%， 100~400r/min下搅拌0. 5~2h，得混合溶液；
[0020] (2)调节上述混合溶液pH值至8~10,加入0. 1~2份钛酸正丁酯，在室温下以 100~400r/min揽摔反应24~36小时，在4000~16000r/min条件下离心5~60min，吸 出上清液加入超纯水或缓冲液清洗，重复1~2次，即制备得表面含有活性-0H的钛酸酯改 性的胶体金颗粒。
[0021] 步骤（1)中，所述胶体金溶液采用氯金酸一柠檬酸三钠还原法制备。
[0022] 步骤⑵中，调混合溶液pH值采用氨水调节。
[0023] 本发明还提供了前述方法制备的改性胶体金。
[0024] 本发明还提供了一种金标抗体的制备方法，步骤如下：取前述的改性胶体金，加入 抗体，胶体金表面活性-0H与抗体Fc段-C00H反应形成稳定键合，形成金标抗体。
[0025] 优选地，所述抗体是Cd单克隆抗体、Pb单克隆抗体、Hg单克隆抗体、As单克隆抗 体、Cr单克隆抗或Cu单克隆抗体。
[0026] 本发明还提供了前述方法制备的金标抗体。
[0027] 本发明还提供了前述改性胶体金或者前述金标抗体在免疫胶体金检测中的用途。
[0028] 优选地，所述免疫胶体金检测是免疫胶体金光镜染色、免疫胶体金电镜染色、胶体 金免疫层析。
[0029] 本发明检测重金属的胶体金免疫层析试剂盒：它包括检测试纸和卡壳，试纸置于 卡壳中；所述检测试纸包括塑料底板1，一端粘贴上样品垫2,上样品垫的一端紧密压接着 含有所检测重金属相对应抗体所标记的金标制作的胶体金垫3,胶体金垫3 -端紧密压接 着硝酸纤维素膜4,硝酸纤维素膜上包被有检测线T和质控线C5,检测线T包被着待检重金 属的完全抗原，质控线C上包被有抗鼠IgG抗体，硝酸纤维素膜另一端连接吸样垫6 ;所述 卡壳表面对应样品垫2的位置设有加样孔7,卡壳表面对应硝酸纤维素膜4的位置设有观察 口 8;其中，胶体金垫上的胶体金为前述方法制备的改性胶体金。
[0030] 优选地，所述胶体金垫上的金标抗体为前述方法制备的金标抗体。
[0031] 优选地，所述重金属的完全抗原是重金属与络合剂络合后，与载体蛋白相偶联形 抗原，其中，所述络合剂是柠檬酸、乙二胺四乙酸、氨基乙酸、1_(4_异硫氰苄基）乙烯基二 胺-N，N，N'，N' -四乙酸、二乙烯三胺五羧酸盐、谷胱甘肽和有机多齿配体中的一种或多种； 所述载体蛋白是牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、卵清蛋白、人血清蛋白中的一种或多种。
[0032] 优选地，所述硝酸纤维素膜是孔径5-12微米的多孔样结构膜，所述样品垫为玻璃 纤维素膜或聚酯膜，所述吸样纸为吸水滤纸。
[0033] 本发明还提供了一种检测重金属的检测系统，它包括前述所述的胶体金免疫层析 试剂盒、干式恒温仪和胶体金读数仪，其中，胶体金读数仪是一种手持式胶体金读数仪。
[0034] 本发明还提供了一种检测重金属的方法，它是前述的检测系统进行检测。
[0035] 优选地，它包括如下步骤：
[0036] 1)使用粉碎机粉碎所需检测样品，并过20目筛网。
[0037] 2)取待检样品，加入2~8倍mL/g的提取剂，在震荡频率为2~60cpm条件下反 应5~30min，过滤，取上清，加入上清2~40倍体积的稀释液，混匀，得混合液；所述提取 剂是浓度为1~15%的硝酸溶液；所述稀释剂为添加有表面活性剂、重金属络合剂的缓冲 溶液；
[0038] 3)将前所述的胶体金免疫层析试剂盒和步骤1)制备的混合液分别放入干式恒温 仪中，恒温2~15min，温度设定为20~45°C;
[0039] 4)在干式恒温仪中，将步骤1)制备的混合液加入试剂盒的加样孔中，恒温反应 5 ~30min;
[0040] 5)将反应后的试剂盒，置于胶体金读数仪中，读取数据即可。
[0041] 进一步优选地，它包括如下步骤：
[0042] 1)取待检样品，加入4倍mL/g的提取剂，在震荡频率为2~60cpm条件下反应 5min，过滤，取上清，加入上清4倍体积的稀释液，混匀，得混合液；所述提取剂是浓度为 10%的硝酸溶液；所述稀释剂为添加有1%tWeen20,1X10 7ITCBEg/mL的0?2MPBS溶液；
[0043] 2)将前述的胶体金免疫层析试剂盒和步骤1)制备的混合液分别放入恒温装置 中，恒温5min，温度设定为37°C;
[0044] 3)在恒温装置中，将步骤1)制备的混合液加入试剂盒的加样孔中，恒温反应 20min；
[0045] 4)将反应后的试剂盒，置于胶体金读数仪中，读取数据即可。
[0046] 本发明改性胶体金是表面含有活性-0H的钛酸酯改性的胶体金颗粒，其与抗