基于磁性分离和量子点标记的人肺炎衣原体快速检测方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种基于磁性分离和量子点标记的检测人 肺炎衣原体（Chlamydiapneumoniae，Cpn)抗原的快速检测方法及检测试剂盒，以及该检测 试剂盒的制备及使用方法。
【背景技术】
[0002] 肺炎衣原体（Chlamydiapneumoniae,Cpn)作为衣原体属的一种重要的呼吸道病 原微生物，自从上个世纪80年代中期由Grayston等人正式命名，在随后的时间里被研究者 们广泛研究。现仅知人是该病原体的宿主，感染方式可能为人与人之间通过呼吸道分泌物 传播。5岁以下儿童极少受染，8岁以上儿童及青年易被感染，尤其是人群聚集处，如家庭、 学校、兵营中易流行，经血清流行病学调查，证实成人中至少有40%已受到该衣原体感染， 大部分为亚临床型。肺炎衣原体是专性细胞内寄生的微生物，寄居于人呼吸道和咽喉等处， 在儿童和成人中产生上呼吸道和呼吸道感染，常引起肺炎和支气管炎等呼吸道疾病。目前 研究表明，其还与动脉粥样硬化综合症、老年痴呆症、心肌炎、哮喘等疾病有关。临床上由于 其与其他呼吸道病原体引起的感染症状类似，因此常难以根据临床表现、x-射线检查等得 出结论，确诊往往依赖于实验室诊断。快速有效的诊断方法应该是在疾病的发病初期就可 以得到明确的诊断，便于实施针对性的治疗，阻止病情的发展迁延。
[0003] 尽管肺炎衣原体在全球范围内传播，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种 类极少。目前，肺炎衣原体感染的诊断方法有血清学检测法，核酸检测法和病原体直接检 测法。检测血清中肺炎衣原体IgG、IgA、IgM抗体常用的有5种方法：微量免疫荧光抗体 检测（MIF)，补体结合试验（CF)，重组酶免疫测定（rEIA)，血清补体结合一酶免疫测定试验 (SeroCF-EIA)，0Y酶免疫试剂盒（LoY-EIA)。这5种方法要求肺炎衣原体不同成分做为 抗原，而且肺炎衣原体抗体的检出只能说明该个体感染过肺炎衣原体，却不能反映体内是 否仍有肺炎衣原体活菌存在，并且血清学特异性抗体检测常需要根据IgM抗体的动态结果 进行判断，需要较长的时间。同时，这些技术均存在灵敏度低、操作步骤复杂、需要专业人员 操作、重复性差、检测时间长、检测特异性差、成本较高等缺陷，因而难以满足临床的实际需 要。
[0004] 核酸检测包括核酸杂交和聚合酶链式反应（PCR)，核酸杂交检测肺炎衣原体的特 异性强，但敏感性不高，主要用于PCR结果的检测、判定，尚未直接用于临床标本的检测； PCR具有较高的敏感性，应用肺炎衣原体外膜蛋白基因片段的一对特异性引物对临床咽拭 子进行PCR测定，其结果与血清学检测具有较好的一致性。但PCR实验对实验室有特殊要 求，标本处理、扩增和检测要求严格，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断 方法。
[0005] 抗原检测方法有鸡胚卵黄囊分离培养和细胞培养法（常用HL和Hep-2两种细 胞），然后采用荧光标记或酶标记抗体检测标本中的衣原体，但该法存在操作步骤复杂，细 胞培养时间长等明显缺陷，并不适合临床应用。近年也尝试直接应用于临床标本的检验，其 敏感性与标本采集有关：痰液和咽拭子涂片后用EIA可检测肺炎衣原体抗原的存在，其敏 感性、特异性和可重复性不理想，且仅限于急性呼吸道感染；酶联免疫吸附试验（ELISA)也 可以直接检出病原体，主要检测肺炎衣原体外膜蛋白-2,所用抗体为抗衣原体属特异性抗 体，不能直接识别肺炎衣原体，与"金标准"（MIF)相比，虽然很灵敏，特异性却不高。
[0006] 因此，目前建立具高灵敏度、高特异性的人肺炎衣原体抗原快速检测法以满足临 床的检测需求就显得非常必要了。
【发明内容】
[0007] 针对【背景技术】中存在的这些技术问题，本发明提供了一种基于磁性分离和量子点 标记的能简便、快速、高灵敏度的检测人肺炎衣原体抗原的检测方法和试剂盒，以及该试剂 盒的制备及使用方法。
[0008] 本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0009] -种基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎衣原体抗原的方法，其特征在于： 所述方法包括以下步骤：
[0010] 1)兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体的制备；
[0011] 2)鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体的制备；
[0012] 3)将步骤1)制备得到的兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体与纳米磁珠通 过共价偶联，制备抗人肺炎衣原体免疫纳米磁珠；
[0013] 4)将步骤2)制备得到的鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体与纳米量子点 通过共价偶联，制备量子点标记的抗人肺炎衣原体纳米探针；
[0014] 5)取人呼吸道分泌物样本（包括但不限于咽拭子），用样品处理液溶解后，加入步 骤3)制备得到的抗人肺炎衣原体免疫纳米磁珠，充分混合，反应10-45min后进行磁分离， 以PBST缓冲液2遍后，向磁分离得到的沉淀物中加入步骤4)制备得到的量子点标记的抗 人肺炎衣原体纳米探针，反应l〇_45min后进行磁分离，以PBST缓冲液洗涤2遍后，使用荧 光酶标仪读取荧光值；所述样品处理液中各组分含量如下：8g/LNaCL，0. 2g/LKC1，0. 24g/ LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,0.3g/LNaN3，10ml/LNonidetP-40，lml/LSDS;所述样品处理 液口11 = 7.4;所述？831'缓冲液中各组分含量如下抑/1恥(^，0.28/11((：1，0.248/1腿2?0 4， 1. 44g/LNa2HP04,0. 3g/LNaN3,0. 5ml/LTween-20 ;所述PBST缓冲液pH= 7. 4 ;
[0015] 6)根据步骤1)-步骤5)的方法分别检测四份经临床确定为人肺炎衣原体阴性的 人群的呼吸道分泌物样品，读取荧光值；所述人肺炎衣原体阴性的人群的呼吸道分泌物样 品简称人肺炎衣原体阴性对照样品；所述四份人肺炎衣原体阴性对照样品的荧光值的平均 值与3倍标准差之和即为⑶T-0FF值；若步骤5)中人呼吸道分泌物样本的检测荧光值大于 CUT-OFF值，则判断为人呼吸道分泌物样本中人肺炎衣原体抗原为阳性；若步骤5)中人呼 吸道分泌物样本的检测荧光值小于⑶T-0FF值，则判断为人呼吸道分泌物样本中人肺炎衣 原体抗原为阴性。
[0016] -种基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎衣原体抗原的试剂盒，其特征在 于：所述试剂盒由具有富集人肺炎衣原体抗原功能的抗人肺炎衣原体免疫纳米磁珠、量子 点标记的抗人肺炎衣原体纳米探针、质控品、样品处理液以及PBST缓冲液所组成；所述质 控品包括阳性质控品以及阴性质控品；所述阳性质控品由灭活的人肺炎衣原体干燥结合到 拭子上而成；所述阴性质控品是经临床确定为人肺炎衣原体阴性的人群的咽拭子。
[0017] -种用于制备基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎衣原体抗原的试剂盒的 方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
[0018] 1)抗人肺炎衣原体免疫纳米磁珠的制备：
[0019] 1. 1)兔及鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体IgG的制备
[0020] 1. 1. 1)重组M98-His融合蛋白的制备、纯化：
[0021] 1. 1. 1. 1)对人肺炎衣原体98KD膜蛋白进行生物信息学分析，获取其胞外保守结 构域中抗原表位最为丰富的肽段；
[0022] 1. 1. 1. 2)找到步骤1. 1. 1. 1)中所得到肽段对应的基因编码序列，在上述基因序 列的5'端及3'端引入酶切位点并化学合成全基因序列，同时标记记为m98 ;其基因序列参 见序列表；
[0023] 1. 1. 1.3)将步骤1. 1. 1.2)中所得到的m98按分子生物学方法克隆入表达载体 pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组M98-His融合蛋白；所述重组M98-His融合蛋白以 包涵体表达方式存在于菌体中；
[0024] 1. 1. 1. 4)用镍柱纯化步骤1. 1. 1. 3)所得到的重组蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后， 以Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度为0. 2mg/mL后备用；
[0025] 1. 1. 2)兔及鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体IgG的制备：
[0026] 1. 1. 2. 1)以步骤1. 1. 1. 4)中所得到的重组M98_His融合蛋白为完全抗原，分别免 疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白抗血清及鼠抗人肺炎衣 原体98KD膜蛋白抗血清；所述兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白抗血清及鼠抗人肺炎衣原体 98KD膜蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于1X105 ;
[0027] 1. 1. 2. 2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白抗 血清及鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG;
[0028] 1. 1. 2. 3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1. 1. 2. 2)所得到的二种 多克隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为lmg/mL后备用；
[0029] 1. 2)免疫纳米磁珠的包被：
[0030] 1. 2. 1)取5mg磁珠，用1mlMES缓冲液洗涤三次，置于纳米磁分离器中进行磁分离 后移除上清；所述磁珠是以超顺磁性Fe304为内核、粒径为350nm的羧基磁珠；所述MES缓 冲液是质量浓度是2g/L的2-(N-吗啉代）乙磺酸；所述MES缓冲液的pH= 6. 0 ;所述纳米 磁分离器的磁性强度是〇. 4T;
[0031] 1. 2. 2)依次加入用步骤1. 2. 1)中的MES缓冲液配制的浓度是8-12mg/ml的EDC 溶液以及用步骤1. 2. 1)中的MES缓冲液配制的浓度是6-12mg/ml的sulfo-NHS溶液各 0. 5ml，以10-40rpm/min于旋转混合仪中活化lhr，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除 上清，用lml步骤1. 2. 1)中的MES缓冲液重悬，得到活化后的磁珠；
[0032] 1.2. 3)取5个离心管，在每个离心管中加入200iiL步骤1.2. 2)所得到的活化 后的磁珠，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，向各离心管中加入用PBS缓冲液 稀释的浓度为50-200iig/ml的由步骤1. 1)所制备的兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克 隆抗体IgG溶液各lml,室温下以15rpm/min于旋转混合仪中反应2-6h，置于纳米磁分离 器中进行磁分离后移除上清后，各加入lml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液，室温下以 15rpm/min于旋转混合仪中反应2h以封闭磁珠上未与抗体反应的羧基；所述PBS缓冲液中 各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04，所述PBS缓冲 液的pH= 7. 4 ;
[0033] 1. 2. 4)封闭反应完成后，将该5个离心管置于纳米磁分离器中进行磁分离后移 除上清，各用lml洗涤缓冲液洗涤三遍；所述洗涤缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,0.5ml/LTween-20,所述洗涤缓冲液的pH= 7.4 ；
[0034] 1. 2. 5)向各个离心管中分别加入lml保存缓冲液重悬磁珠，置于4°C保存备用； 所述保存缓冲液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/L Na2HP04,0. 3g/LNaN3,5g/L牛血清白蛋白（BSA)，所述保存缓冲液的pH= 7. 4 ;
[0035] 2)量子点标记的抗人肺炎衣原体纳米探针的制备：
[0036] 其具体制备方法包括：
[0037] 2. 1)向微量离心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子点、300nmolN-羟基琥珀酰 亚胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亚胺EDC，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，混合溶液，37°C反 应30min后，透析去除过量的作为活化剂的sulfo-NHS及E：DC，得到活化后的量子点；所述 磷酸盐缓冲液中各成分含量