生物标记鉴定方法和系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鉴定指示受试的哺乳动物状况的生物标记的方法。本发明另外涉及鉴 定指示受试的哺乳动物状况的生物标记的计算机辅助系统。
【背景技术】
[0002] 通常根据多种症状评估受试者的健康状况。然而，今天所用的许多症状由于其主 观性描述和与疾病状态的不确定关系而令人误解。
[0003] 术语"生物标记（生物学标记）"是在1989年作为医学主题词（MeSH)术语引 入的，被定义为一种客观的测量和评价的特性，作为正常的生物过程、致病过程，或治疗 干预的药物反应的指标。在过去数十年间生物标记的发现有了巨大的发展。生物标记 在药用生物学中起到了重要作用。生物标记有助于早期诊断、疾病预防、药物靶点识别、 药物反应等。已经识别出针对许多疾病的若干生物标记，诸如针对胆固醇的血清LDL、血 压、针对癌症的P53基因（Loukopoulos P，Thornton JR，Robinson WF(2003年5月）。 "Clinical and pathologic relevance of p53index in canine osseous tumors'，。Vet. Pathol.40(3) :237 - 48. doi : 10. 1354/vp. 40-3-237)和MMPs(Loukopoulos P，Mungall BA，Straw RC，Thornton JR，Robinson WF(2〇〇3年7月）。"Matrix metalloproteinase-2 and-9 involvement in canine tumors'，。Vet. Pathol. 40 (4) ：382 - 94. doi ：10. 1354/ vp. 40-4-382)等。在20世纪90年代中期DNA微阵列的引入产生了转录组学的革命并引发 生命科学家研究方式的重大转变。随后，代谢组学和代谢物组学，起初主要应用于安全相关 的生物标记，开始转向疾病相关的生物标记。
[0004] 科学家持续努力以发现与健康或疾病的深层原因密切关联的新的生物标记。他们 的发现是通过给医生们一个更客观和可量化的临床决策的基础来改变医学实践。口腔内发 现的微生物群落，其结构或功能随病情的进展而变化，提供最有价值的线索中的一个。
[0005] 口腔是微生物定植的主要位点。口腔微生物群落在不同个体间、相同口腔内的不 同位点间或相同位点的不同时间点间变动。微生物群落的差异决定了 口腔微生物生态系统 的平衡，其与口腔健康状态和甚至整个系统健康状态直接相关。然而发现生物标记必须从 微生物群落中数以万计的微生物类型进行选择，这提出了挑战。
[0006] 齿龈炎（其涉及牙周软组织的炎症）是最普遍的感染和最常见的人类口腔疾病中 的一种。作为一个世界性的健康问题，它影响了大多数儿童和青少年。这种疾病据信是牙 斑的积累和随后的牙斑微生物和宿主组织间相互作用所引起的。虽然没有发生结合上皮的 根向移动，在探查时这些组织变成结节状红斑并且出血。此外，慢性齿龈炎可发展成牙周 炎，这是不可逆的牙周感染，其特征在于齿槽骨的损耗、附件损耗、形成牙周腔洞和最终牙 缺失。因此，针对齿龈炎的预防性测量，以及用于其预后和早期诊断的改善的工具有特别重 要的临床意义。
[0007] 若干因素阻碍了齿龈炎的病原性调查，这仍然知之甚少。在实际人群中，齿龈炎 症状可为可逆的和不稳定的，因为多个内部或外部因素，包括口腔卫生操作（个人的或职 业的）、免疫系统损伤、受伤、饮食和口腔状态，可潜在地影响疾病发展从而混淆疾病监测。 此外，齿龈炎的临床诊断是基于单个观察并且是由人类检查者进行判断。因此，很难在不 同病人和不同检查者之间比较结果。此外，虽有口腔微生物群落和慢性口腔感染的疑似多 重细菌性质的复杂性，齿龈炎相关联的微生物群的族群调查通常限于仅少数可培养的细菌 (例如"红色复合物"包括牙銀卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis)、福赛斯坦纳菌 (Tannerellaforsythia)和齿垢密螺旋体（Treponemadenticola))，这些细菌提供的数据 点对于可能引起齿龈炎的各种微生物的彻底分析是不够的。
[0008] 因此，仍然需要改进诊断方法用于评估受试者的健康状况。仍然需要调查疾病的 病源学。仍然需要识别能够充当更敏感、更可靠和更客观的疾病测量的生物标记。仍然需 要准确测定受试者对于疾病的易感性以便阻止和控制不期望的状况和疾病。
【发明内容】
[0009] 为了应对这些挑战和/或需求，设计了与口腔微生物群落的分析结合的减退-发 展模型（RPM)以调查疾病的病源学。
[0010] 在一个方面，本发明涉及一种鉴定指示受试哺乳动物的状况的生物标记的方法， 所述方法包括以下步骤：
[0011] a)选择具有第一疾病的第一组测试哺乳动物；
[0012] b)获取第一口腔样品，所述第一 口腔样品包含来自具有第一疾病的第一组测试哺 乳动物中的每一个哺乳动物的第一微生物群落，其中所述第一微生物群落包含一种或多种 微生物类型；
[0013] c)治疗已进行第一口腔取样的具有第一疾病的第一组测试哺乳动物中的每一个 哺乳动物，以便消除或减少第一疾病；
[0014] d)获取第二口腔样品，所述第二口腔样品包含来自经过治疗的第一组测试哺乳动 物中的每一个哺乳动物的第二微生物群落，其中所述第二微生物群落包含一种或多种微生 物类型；
[0015] e)使第一疾病在已进行第二口腔取样的第一组测试哺乳动物中的每一个哺乳动 物中复发；
[0016] f)获取第三口腔样品，所述第三口腔样品包含已复发第一疾病的第一组测试哺乳 动物中的每一个哺乳动物的第三微生物群落，其中所述第三微生物群落包含一种或多种微 生物类型；
[0017] g)测量所述第一口腔样品、第二口腔样品和第三口腔样品以分别获得在第一微生 物群落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种或多种微生物类型的丰度；
[0018] h)对获得的在跨第一组测试哺乳动物的第一微生物群落、第二微生物群落和第 三微生物群落中的一种或多种微生物类型的丰度进行统计学分析，以鉴定其丰度与第一组 测试哺乳动物的状况具有统计显著性的相关性的那些微生物类型为第一组微生物类型，其 中所述状况选自：第一疾病的存在、所述疾病的严重性、对所述疾病的敏感性以及它们的组 合；
[0019] i)从所述第一组微生物类型中选择一种或多种作为指示所述受试哺乳动物的状 况的生物标记。
[0020] 在另一方面，本发明涉及鉴定指示受试哺乳动物的状况的生物标记的计算机辅助 系统，其包括：
[0021] a)用于取样的取样部分：
[0022] 1)第一口腔样品，所述第一口腔样品包含来自具有第一疾病的一组测试哺乳动物 中的每一个哺乳动物的第一微生物群落，其中所述第一微生物群落包含一种或多种微生物 类型，
[0023] 2)第二口腔样品，所述第二口腔样品包含来自经过治疗以消除或减少所述疾病的 该组测试哺乳动物中的每一个哺乳动物的第二微生物群落，其中所述第二微生物群落包含 一种或多种微生物类型，和
[0024] 3)第三口腔样品，所述第三口腔样品包含已复发所述疾病的该组测试哺乳动物中 的每一个哺乳动物的第三微生物群落，其中所述第三微生物群落包含一种或多种微生物类 型；
[0025] b)与取样部分相联的测量部分，其中所述测量部分被配置用于测量第一 口腔样 品、第二口腔样品和第三口腔样品，以分别获得在第一微生物群落、第二微生物群落和第三 微生物群落中的一种或多种微生物类型的丰度；和
[0026] c)与测量部分相联的计算部分，其中所述计算部分被配置用于接收并对所获得的 在跨该组测试哺乳动物的第一微生物群落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种或 多种微生物类型的丰度进行统计学分析，以鉴定其丰度与该组测试哺乳动物的状况具有统 计显著性的相关性的那些微生物类型为指示所述受试哺乳动物的状况的生物标记，
[0027] 其中所述状况选自：第一疾病的存在、所述疾病的严重性、对所述疾病的敏感性以 及它们的组合。
[0028] 本方法和系统是基于以下概念：平衡的口腔环境是口腔健康和卫生状态的指示 灯，特别是就微生物群落的平衡而言。通过将RPM和口腔微生物群落分析相结合实现了本 发明。RPM是减退-发展模型，其包括两个区段，S卩，从疾病状态至健康状态的第一区段和从 健康状态至疾病复发状态的第二区段。微生物群落分析在过去被限制在仅一个区段中，例 如从疾病状态至健康状态或从健康状态至疾病状态。通过将RPM和口腔微生物群落分析相 结合，本发明提供了鉴定生物标记的有效方法，所述生物标记能用作健康状态的客观的、可 再现的和敏感的度量。
[0029] 对于本领域的技术人员来说，通过下面的详细描述，本发明的这些和其它的特征、 方面和优点将变得显而易见。
【附图说明】
[0030] 虽然在说明书之后提供了特别限定和清楚地要求保护本发明的权利要求书，但据 信通过以下【附图说明】可更好地理解本发明。在这些附图中，
[0031] 图1A示出了根据本发明的具体实施例模拟人群中齿龈炎发展的纵向研究的设 计。图1B示出了针对50个受试者在整个研究的不同时间点某些临床参数的值。
[0032] 图2示出了根据本发明的具体实施例所述方法的研究流水线。
[0033] 图3示出了根据本发明的具体实施例，27个属水平上的生物标记丰度，所述生物 标记区分50个受试者中健康状态和齿龈炎状态（同时包括天然存在的齿龈炎状态和实验 诱导的齿銀炎状态）。
[0034] 图4A和4B示出了根据本发明的具体实施例，针对从50个受试者在三种不同状态 下（即，天然存在的齿龈炎状态（"NG"）、基线状态（"基线"）和实验诱导的齿龈炎状态 ("EG")）收集的150个口腔样品，来自测得的属级上的细菌数据的主成分分析（PCA)的主 成分1和2(PC1和PC2)的曲线图。
[0035] 图5A和5B示出了根据本发明的具体实施例，牙斑微生物群的生物体结构的主坐 标分析（PCoA)。每个点对应于微生物群落。图5A是基于UniFrac距离的；并且图5B是基 于thetaYC距离的。
[0036] 图6A、6B和6C是根据本发明的具体实施例，示出了通过PCA分析鉴定的15个齿 龈炎驱动属之间的相互作用的相关性网络。
[0037] 图7A示出了健康状态和齿龈炎微生物群之间的功能差异；图7B示出了 16S rRNA 基因序列对相邻类的聚簇（Clusters of Orthologous Groups，COG)的普式叠合分析 (Procrustes analysis);图 70不出了 33 个齿銀炎富集的相邻类（orthologous groups， 0G，其编码鞭毛生物合成途径的组分）。
[0038] 图8A、8B、8C和8D示出了根据本发明的具体实施例，两种具有不同齿龈炎敏感性 的宿主类型的鉴定。图8A示出了微生物群结构（即PC1-值）变化的模式和沿RPM的Mazza 齿龈指数变化。图8B示出了 50个受试者沿PCA的主成份1和2 (PCI和PC2)的分布，其中 垂直的虚线将50名受试者分成I型和II型宿主。图8C示出了在I型和II型宿主间的齿 龈炎敏感性的差异。图8D示出了区分I型和II型宿主的8个属级细菌生物标记的丰度。
[0039]图9示出了基于齿龈炎的存在、使用齿龈炎微生物指数MiG27的试用分类，所述 MiG27是由基于根据本发明的具体实施例鉴定的27个生物标记的丰度的函数计算出来的。
[0040] 图10示出了基于齿龈炎的严重程度、使用齿龈炎微生物指数MiG15的试用分类， 所述MiG15是由基于根据本发明的另一个具体实施例鉴定的15个生物标记的丰度的函数 计算出来的。
[0041]图11示出了基于对齿龈炎的敏感性、使用齿龈炎微生物指数MiG-S的试用分类， 所述MiG-S是由基于根据本发明的另外的具体实施例鉴定的8个生物标记的丰度的函数计 算出来的。如左图所示通过基于牙斑微生物群的（即基于MiG-S的）齿龈炎敏感的宿主类 型分类的R0C (受试者操作特性）曲线下方的面积来测量MiG-S的准确性。
【具体实施方式】
[0042] 定义
[0043] 如本文所用，术语"哺乳动物"是指各种哺乳动物纲的温血脊椎动物的任一种，包 括人类。在本文上下文中，哺乳动物也可被称为"受试者"或"宿主"。
[0044] 如本文所用，术语"一组哺乳动物"是指出于研究目的将多个哺乳动物聚成一组。 组内的数量可为任一大于1的可数数目。根据具体研究的目的准确度的需要，组内哺乳动 物的数目可多达1000,10000或甚至更大。
[0045] 如本文所用，术语"微生物群落"、"微生物群"、"微生物区系"、"微生物菌丛"和"群 落"在本文互换使用，是指一组各种不同的通常栖息于身体器官或部分的微生物。术语"微 生物"意为微观或亚微观尺寸的有机体，特别是细菌或原生动物，更优选地为细菌。
[0046] 如本文所用，术语"微生物相关的疾病"包括由微生物导致的或影响的或相关联的 疾病。
[0047] 如本文所用，术语"样品"、" 口腔样品"、或"生物样品"是从受试者分离的生物材 料，用于按照本方法进行分析，诸如唾液、龈沟液（GCF)、龈上菌斑、龈下菌斑、吸入或呼出的 空气、口腔灌洗、舌刮片、口腔组织拭子或活检和血清。理想的样品能够包含微生物群落。
[0048] 如本文所用，术语"统计显著性"是一种数学工具，用于确定实验的结果是具体因 素间关系的结果或仅为随机的结果。统计显著性被用于拒绝或接受所谓的零假设。假设是 研究人员试图证明的解释。零假设通常认为，研究者所研究的因素对数据上的差异并没有 影响，或这些因素之间没有联系。统计显著性通常写作例如t = 0.02、p〈0. 05。这里，"t" 表示检验分数，并且"P〈〇. 05"意为事件偶然发生的概率小于5%。这些数字会使得零假设 被拒绝。
[0049] 如本文所用，参考疾病或状况，术语"敏感性"和它的形容词形式"敏感的"可与"易 感性"和其形容词形式"易感的"互换使用，表示在暴露于有害刺激或病原体时患疾病或病 症的可能性。
[0050] 如本文所用，当用于权利要求中时，冠词"一个"和"一种"被理解为是指一种或多 种受权利要求书保护的或根据权利要求书所述的物质。
[0051] 如本文所用，术语"包含"、"包括"、"含有"、"具有"的含义是非限制性的，即可加入 不影响结果的其它步骤和其它节段。以上术语涵盖术语"由……组成"和"基本上由……组 成"。
[0052] 减退-发展樽铟（RPM)
[0053] 本发明是基于减退-发展模型（RPM)的，其被设计来模拟哺乳动物病害的退化和 复发。在代表自然发病状态、健康状态和疾病复发状态的三个不同时间点获取口腔样品。因 此，RPM可以用于显示出受试者内和自然种群中两者的微生物群的异质性源。
[0054] 该RPM显示出在受试者内如上文所述的不同时间点的和对疾病具有不同敏感性 的受试者之间微生物群的异质性源。在任一种情况下，如它们的微生物属性所反映的，宿主 中健康状态和疾病状态间没有清晰的界限：它们（微生物）的分布以及它们的退行性或渐 进模式不是分立的而是一个梯度样（渐变）的过程。不受理论的束缚，据信从相对健康的 状态发展至疾病状态主要是由某些细菌驱动的，在此类发展过程中其大多数丰度增加而其 中一些丰度降低。因此，RPM可用于模拟微生物相关疾病的减退和复发，其优选地但不一定 是口腔疾病。
[0055] 根据具体的实施例，所述生物相关疾病选自：齿龈炎、牙周炎、龋齿、口