一种近红外磷光铱配合物的合成及其荧光检测成像应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于氨基酸检测领域，更具体地，本发明涉及一种磷光铱配合物的合成及 其用于含巯基的半胱氨酸和高半胱氨酸的检测，该种磷光铱配合物具有检测半胱氨酸和高 半胱氨酸的有益效果。
【背景技术】
[0002] 半胱氨酸（Cys)和高半胱氨酸（Hcy)是含巯基的氨基酸，属于人体中的硫醇，能够 平衡生物体内的氧化还原反应，体内半胱氨酸和高半胱氨酸的含量与人体身体健康状况紧 密相关。研究表明，半胱氨酸含量高低会影响人体生长速度，造成水肿、肝损伤等疾病。高 半胱氨酸在新陈代谢和内稳态过程中扮演非常重要的角色。Hcy与人类的心血管疾病、进行 性老年痴呆症有直接关联，血清内高半胱氨酸的高水平是心血管疾病的风险因子，因此发 展Cys和Hcy的检测方法具有重要意义。常见检测硫醇的方法有色谱法和电化学法等，虽 然这些方法能很好地检测出硫醇的存在，但这些方法在存在一定的局限性，如设备成本高、 操作复杂、耗时长等。因此，需要发展一种简单、实时可视化的检测方法用于硫醇的检测。 [0003] 荧光成像检测是一种价格低廉的灵敏非侵入式可视化检测技术，荧光成像手段具 有监测灵敏、成像迅速和可同时观测多分子事件等优点。另外，荧光探针的丰富促进了荧光 成像技术的发展，目前荧光染料大概分为以下几类：（1)有机荧光染料；（2)磷光金属配合 物；（3)半导体量子点；(4)荧光蛋白等。其中，磷光铱配合物与传统的荧光染料相比具有优 异的磷光物理性质，如具有Stokes位移大、发光效率高、光稳定性好、发光颜色可调、发光 寿命长等优点。磷光铱配合物具有较长的发光寿命，通过时间分辨技术可以有效地消除自 发荧光的影响。基于以上的优点，已经发展了铱配合物的荧光探针用于半胱氨酸和高半胱 氨酸的荧光检测，但是目前磷光铱配合物用于半胱氨酸和高半胱氨酸的检测限于体外离体 检测和细胞层次的荧光检测成像，而未实现小动物活体荧光成像检测，主要困难在于以下 方面：（1)多数的配合物荧光探针的激发光位于紫外区域，而位于紫外区域的激发光在活 体荧光成像上存在组织穿透深度不够、对活体组织有光损伤的缺点；（2)配合物荧光探针 的发光量子效率低，不能很好地实现活体荧光成像的应用。所以，本发明针对以上的困难， 通过设计与合成近红外磷光发射的铱配合物的荧光探针，发展了该探针用于细胞和活体层 次上的半胱氨酸和高半胱氨酸的荧光成像检测。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种磷光铱配合物的合成，该配合物具有醛基结构，可以用于检测 半胱氨酸或高半胱氨酸，而且配合物的发射光谱位于近红外区域，具有光损伤小、组织穿透 性强的特点，可用于细胞和活体的荧光成像。
[0005] 1.本发明提供的一种磷光铱配合物化学式为[Ir(CH0-btiq)2(bpy)] [PF6]，结构 式如式1所示
[0006]
[0007] 2.本发明还提供了该配合物的合成方法，合成步骤如下：
[0008] a)称取2-4mmol的2-氯喹啉-3-甲醛和2-4mmol的苯并噻吩-2-硼酸于IOOmL 圆底烧瓶中，加入3摩尔当量碳酸钾，加入40-50mL体积比V/V= 1 :1的四氢呋喃和水混合 溶剂，最后加入8%摩尔当量的四（三苯基磷）钯，在氮气保护气氛中70°C加热回流24至 48小时。反应结束后，用二氯甲烷萃取，水相用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用无水硫酸 钠干燥过夜，柱层析分离，得到结构式如式II的配体。
[0009]
[0010] b)称取l_2mmol的配体II，0. 5-lmmol的三水合氯化铱于50mL圆底烧瓶中，加入 20-30mL体积比V/V= 3 :1的乙二醇乙醚和水混合溶剂，在氮气气氛中IKTC加热回流24 至48小时。反应得到红褐色沉淀，减压抽滤，用水和乙醇洗涤3次，得到如式III的二氯桥 铱配合物。
[0011] c)称取0. 2-0. 5mmol的二氯桥配合物，0. 4-1.Ommol的1，10-邻菲罗啉于50mL圆 底烧瓶中，加入24-30mL体积比V/V= 1 :2的甲醇和二氯甲烷混合溶剂，在氮气气氛中50°C 加热回流5-10小时，向反应体系中加入5-10摩尔当量六氟磷酸钾，室温下搅拌2至4小 时，减压抽滤收集滤液，进行柱层析分离，得到结构式I的铱配合物[Ir(CH0-btiq)2(bpy)] [PF6] 〇
[0012] 3.本发明还提供该磷光铱配合物在检测半胱氨酸和高半胱氨酸中的应用，在所述 的应用中：
[0013] a)用体积比V/V= 4:1的乙腈和水混合溶剂将该磷光铱配合物配制成10-20yM 的稀溶液；
[0014] b)配制l-2mmol的半胱氨酸或高半胱氨酸水溶液；
[0015] c)在铱配合物的稀溶液中加入0-40摩尔当量的半胱氨酸、高半胱氨酸水溶液， 37°C反应5小时；
[0016] d)用荧光分光光度计检测铱配合物溶液的荧光变化。
[0017] 4.本发明还提供了该磷光铱配合物在相同条件下对其他氨基酸的响应情况，在所 述的应用中：
[0018] a)用体积比V/V= 4:1的乙腈和水混合溶剂将该磷光铱配合物配制成10yM的稀 溶液；
[0019] b)配制浓度为l-2mmol的常见的氨基酸水溶液，包括甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、 谷胱甘肽、甲硫氨酸、精氨酸、酪氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏 氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸；
[0020] c)在铱配合物稀溶液中加入相同当量的上述氨基酸水溶液，37°C反应5小时； [0021]d)用荧光分光光度计检测铱配合物溶液的荧光变化。
[0022] 5.该发明提供了该磷光铱配合物在细胞成像中的应用，在所述应用中：
[0023] a)将5yM的铱配合物PBS溶液加入到细胞培养液中，在37°C下孵化30min，用激 光共聚焦荧光显微镜进行细胞荧光成像，收集荧光通道为650 ±IOnm和680 ± 10nm。
[0024] b)分别往上述含铱配合物培养液中加入50yMCys和Hcy，在37°C下孵化3小时， 用激光共聚焦荧光显微镜进行细胞荧光成像，收集荧光通道为650 ±IOnm和680 ± 10nm。
[0025] 6.该发明提供了该磷光铱配合物在细胞成像中的应用，在所述应用中：
[0026] 将100yL的10yM铱配合物生理盐水溶液通过皮下注射到裸鼠的腹部，同时注射 100yL的100yMHcy生理盐水溶液。采用515nm激光器进行激发，收集的荧光范围为大于 630nm的发射信号。
[0027] 有益效果：鉴于目前半胱氨酸和高半胱氨酸的检测磷光铱配合物探针，其激发光 的缺陷不能有效地实现荧光活体成像。磷光铱配合物具有显著的结构功能关系，可以通过 改变配体结构来改变配合物的功能和性质，可以使磷光铱配合物的发射光谱落在近红外区 域。近红外荧光探针在生物成像中具有光损伤小、组织穿透性强和背景自发荧光干扰小的 特点，在生物成像上具有优势。综上所述，我们通过改变铱配合物的配体结构，使磷光铱配 合物具有半胱氨酸、高半胱氨酸检测和近红外发光的性能，将该荧光探针用于细胞和活体 上半胱氨酸和高半胱氨酸的可视化荧光成像检测。
【附图说明】
[0028] 图1铱配合物[Ir(CHO-btiq) 2 (bpy) ] [PF6]溶液加不同当量半胱氨酸的吸收光谱。
[0029] 图2铱配合物[Ir(CHO-btiq)2(bpy)] [PF6]溶液加不同当量半胱氨酸的磷光发射 光谱。
[0030] 图3铱配合物[Ir(CHO-btiq)2(bpy)] [PF6]溶液加不同当量高半胱氨酸的吸收光 谱。
[0031] 图4铱配合物[Ir(CHO-btiq)2(bpy)] [PF6]溶液加不同当量高半胱氨酸的磷光发 射光谱。
[0032] 图5铱配合物[Ir(CHO-btiq)2(bpy)] [PF6]对半胱氨酸/高半胱氨酸的特异性响 应。
[0033] 图6铱配合物[Ir(CH0-btiq)2(bpy)] [PF6]的细胞荧光成像。
[0034] 图7铱配合物[Ir(CHO-btiq) 2 (bpy) ] [PF6]的活体荧光成像。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
[0036] 下文给出了本发明化合物的具体实施例，但对本发明不构成任何限制。本实施例 中所用的原料均为已知化合物，可以由商业途径获得，或可按相关文献设计方法合成。
[0037] 在下述实施例中，所涉及的理化参数由下述仪器测定的=1HNMR谱在Bruker AVANCE核磁仪上采用400MHz测定；质谱数据在AppliedBiosystemsVOYGERDE-STR型质 谱仪上测得；紫外可见吸收光谱在ShimadzuUV-2700型紫外-可见吸收光谱仪上完成；磷 光发射光谱由PerkinElmerLS-55荧光光谱仪测定；细胞荧光成像在OLYMPUSFV1000型激 光共聚焦荧光显微镜上进行；荧光活体成像在CLINXIVScope7550活体成像系统上完成。
[0038] 实施例1
[0039] 铱配合物[Ir(CHO-btiq)2(bpy)] [PF6]的合成：
[0040] (a)称取4mmol(766. 4mg) 2_氣陸琳_3_甲酸和4mmol(712.Img)苯并噻吩-2-棚 酸于IOOmL圆底烧瓶中，加入3摩尔当量碳酸钾，加入40mL体积比V/V=1 :1的四氢呋喃 和水混合溶剂，最后加入8%摩尔当量的四（三苯基磷）钯，在氮气保护气氛中70°C加热 回流24小时。反应结束后，反应液用二氯甲烷萃取，水相用二氯甲烷萃取三次（3X10mL)， 合并有机相，用无水硫酸钠干燥过夜，减压除去溶剂后柱层析分离，得到式II的配体 CHO-tbiq。核磁表征数据：?NMR(400MHz，CDCl3)S=10. 55 (s，1H)，8. 82 (s，1H)，8. 23 (d，J =8. 5Hz, 1H) , 8. 01 (d,J= 8. 0Hz, 1H) , 7. 98 - 7. 92 (m, 1H) , 7. 89 (dd,J= 7. l，5.9Hz，2H)，7.65(t,J= 7.5Hz,lH)，7.60(s,lH)，7.50 - 7.39(m，2H);质谱表征数据： MALDI-T0F-MS:m/z322. 7 (M+)〇
[0041 ] (b)称取lmmol(290. 3mg)配体II(CH〇-tbiq)，0? 5mmol三水合氯化铱于 50mL圆底 烧瓶中，加入28mL体积比V/V= 3 :1的乙二醇乙醚和水混合溶剂，在