丹参酸甲酯磺酸钠的制备方法和应用
【专利说明】
[0001] 本申请为申请号CN201410093547. 0,申请日为2014年3月14日，申请名称为："丹 参酸甲酯磺酸钠的制备方法和应用"的专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及药物领域，具体涉及丹参酸甲酯磺酸钠的制备方法和应用。
【背景技术】
[0003] 丹参，又名血参、赤根、红根、血生根，为唇形科植物（Salviamiltiorrhza)的根 茎，其入药始载于《神农本草经》。中医认为，其味苦微寒，具有活血痛经、祛瘀止痛、清心除 烦、凉血消痈的功效，适用于治疗月经不调、痛经、经闭、崩漏、带下、冠心病、动脉粥样硬化、 高血脂、心绞痛、跌打淤血、失眠、神经衰弱、乙肝等疾病，为妇科、内科及外伤科证属血瘀兼 热者常用。
[0004] 现代药学研究表明，丹参中化学成分复杂，主要为水溶性丹参酚酸类和脂溶性二 萜醌类丹参酮类化合物。其中，丹参酮类化合物主要包括丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮 IIB、异丹参酮I、异丹参酮IIA、隐丹参酮、异隐丹参酮、甲基丹参酮、羟基丹参酮等。
[0005] 丹参酮IIA是重要的丹参有效成分。丹参酮IIA磺酸钠（SodiumTanshinoneIIA Sulfonate，STS)，则是丹参酮IIA经磺化后得到的水溶性磺酸盐。由于磺酸基的引入，在治 疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞等疾病方面，丹参酮IIA磺酸钠相比丹参酮IIA具有更多的优 越性，从而成为主要的心血管类丹参提取物中药。
[0006] 丹参酮IIA是制备丹参酮IIA磺酸钠的原料，从丹参药材饮片提取，故难免混有少 量、或极低含量其他结构较为相似的组分，如丹参酮IIB、丹参酮I、隐丹参酮、紫丹参甲素 等。若要制备高纯度丹参酮IIA磺酸钠，则获得这些极低含量相关组分标准品、以及这些标 准品在丹参酮IIA磺酸钠原料相关成分含量控制中的应用，具有重要意义。
[0007] 但是，由于该类化合物结构复杂，化学全合成难度大，要获得高纯度对照品成为挑 战。有研究报道从丹参酮IIA磺酸钠原料药中提取相关物质，由于其含量极低，HPLC纯度 通常不到百分之一，采用高效液相法分离提取，工作量大、难度高。因此，丹参提取物中极低 含量组分的高纯度标准品规模化制备，及其在丹参酮IIA磺酸钠原料药相关物质含量监控 中的应用成为本领域长期以来难以解决的技术难题。
[0008] 丹参酸甲酯也是丹参脂溶性二萜醌类化合物有效成分之一，并且尚未有技术大量 制备丹参酸甲酯磺酸钠的报道。现有技术中专利CN200610039234. 2"一组从丹参中提取的 二萜醌类化合物的磺化物在医药中的应用"表明丹参酸甲酯磺酸钠可以应用于治疗冠心病 (包括心绞痛，心肌梗死，心律失常，心肌血供应不足）和抗菌消炎等。因此，定量控制丹参 酸甲酯磺酸钠，对丹参酮IIA磺酸钠原料的质量保证具有重要意义。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中丹参酸甲酯磺酸钠提纯困 难、效率低、提取量低的缺陷，提供了丹参酸甲酯磺酸钠的制备方法和应用。本发明的制备 方法的制备能力强、制备量大、周期短、纯度高、效率高，并且减少了有机溶剂的使用，工艺 操作连续性强易于进行质量控制和生产。
[0010] 本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
[0011] 本发明的丹参酸甲酯磺酸钠的结构如下式所示：
[0012]
[0013] 本发明提供了丹参酸甲酯磺酸钠的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反 相色谱法分离丹参酮类磺化液，即可；
[0014] 其中，高效液相反相色谱法的条件如下：
[0015] 流动相A为0. 1 %三乙胺-水、流动相B为0. 1 %三乙胺-甲醇；或，流动相A为 0. 1 %二乙胺-水、流动相B为0. 1 %二乙胺-甲醇；或，流动相A为0. 1 %氨水、流动相B为 甲醇；百分比为组分占流动相的体积百分比；检测波长为271nm，保留时间为35~50min。
[0016] 其中，所述的高效液相反相色谱法较佳地包括富集纯化、中间纯化和精制纯化，其 中，所述的富集纯化的条件优选如下：
[0017] 流动相A为0. 1 %三乙胺-水、流动相B为0. 1 %三乙胺-甲醇；或，流动相A为 0. 1 %二乙胺-水、流动相B为0. 1 %二乙胺-甲醇；或，流动相A为0. 1 %氨水、流动相B为 甲醇；流速为80~120mL/min(较佳地为100mL/min)，检测波长为271nm;
[0018] 将丹参酮类磺化液与流动相A按体积比为1:4的混合物上样25min，80%流动相 A+20 %流动相B(体积分数）平衡lmin，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯 度洗脱40min:80%A+20%B- 40%A+60%B，再以100%流动相B再生lOmin，收集保留 时间为42~50min的洗脱液得到富集纯化样品溶液；
[0019] 采用美国Varian公司的Pr印StarSD-I制备系统和L&L4002色谱柱（内径50mm)， 装Varian公司的PLRP-S反相C18聚合物填料160.Og(粒径10ym，孔径IOnm)，动态轴向 压缩系统装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。
[0020] 其中，所述的中间纯化的条件优选如下：
[0021] 流动相A为0. 1 %三乙胺-水、流动相B为0. 1 %三乙胺-甲醇；或，流动相A为 0. 1 %二乙胺-水、流动相B为0. 1 %二乙胺-甲醇；或，流动相A为0. 1 %氨水、流动相B为 甲醇；流速为80~120mL/min(较佳地为100mL/min)，检测波长为271nm;
[0022] 将上述富集纯化样品溶液与水按体积比为1:1的混合物上样lOmin，80%流动相 A+20%流动相B(体积分数）平衡lOmin，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性 梯度洗脱40min:80%A+20%B- 40%A+60%B，再以100%流动相B再生lOmin，收集保 留时间为36~44min的洗脱液得到中间纯化样品溶液；
[0023] 采用美国Varian公司的Pr印StarSD-I制备系统和L&L4002色谱柱（内径50mm)， 装Varian公司的PLRP-S反相C18聚合物填料160.Og(粒径10ym，孔径IOnm)，动态轴向 压缩系统装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。
[0024] 其中，所述的精制纯化的条件优选如下：
[0025] 流动相A为0. 1 %三乙胺-水、流动相B为0. 1 %三乙胺-甲醇；或，流动相A为 0. 1 %二乙胺-水、流动相B为0. 1 %二乙胺-甲醇；或，流动相A为0. 1 %氨水、流动相B为 甲醇；流速为20~30mL/min(较佳地为25mL/min)，检测波长为271nm;
[0026] 将上述中间纯化样品溶液与水按体积比为1:1的混合物上样lOmin，80%流动相 A+20%流动相B(体积分数）平衡lOmin，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性 梯度洗脱30min:80%A+20%B- 50%A+50%B，再以100%流动相B再生lOmin，收集保 留时间为45~50min的洗脱液得到精制纯化样品溶液；
[0027] 采用美国Varian公司的Pr印StarSD-I制备系统和L&L4001色谱柱（内径25mm)， 装瑞典Kromasil公司的反相C18硅胶填料100.Og(粒径10ym，孔径IOnm)，动态轴向压缩 系统装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。
[0028] 其中，所述的丹参酮类磺化液可为本领域常规的丹参进行磺化反应的反应液，较 佳地通过下述步骤制得：
[0029] (1)将丹参提取物溶解于冰醋酸-乙酸酐的混合溶液中，再加入浓硫酸-冰醋酸的 混合溶液，进行反应得到反应液；
[0030] (2)将石油醚、二氯甲烷和水的混合溶液加入步骤（1)的反应液，再加入氯化钠溶 液，抽滤，得到滤饼；
[0031] (3)用石油醚-二氯甲烷的混合溶液浸泡步骤（2)的滤饼，抽滤干燥得粗品；
[0032] (4)用甲醇溶解步骤（3)的粗品，活性炭过滤，滤液浓缩，冷却结晶过滤，滤液即为 丹参酮类磺化液。
[0033] 其中，所述的冰醋酸-乙酸酐的混合溶液与所述的丹参提取物的体积质量比较佳 地为7~9ml/g。
[0034] 其中，所述的冰醋酸-乙酸酐的混合溶液较佳地为冰醋酸与乙酸酐体积比为1 : (2~3)的混合溶液。
[0035] 其中，所述的浓硫酸-冰醋酸的混合溶液较佳地为浓硫酸与冰醋酸体积比为1:1 的混合溶液，所述的浓硫酸的质量分数较佳地为98 %。
[0036] 其中，所述的石油醚、二氯甲烷和水的混合溶液较佳地为石油醚、二氯甲烷和水的 体积比为1:2: (2~2. 5)的混合溶液。
[0037] 其中，所述的石油醚-二氯甲烷的混合溶液较佳地为石油醚与二氯甲烷体积比为 1:3的混合溶液。
[0038] 其中，所述的丹参提取物可为本领域常规方法得到的丹参提取物，较佳地通过下 述步骤制得：将丹参用乙醇提取，过滤，滤液浓缩，干燥，即得。
[0039] 本发明中，色谱柱的柱温较佳地为10~30°C。
[0040] 本发明的制备方法中，所述的精致纯化结束后还可包括冻干过程。所述的冻干过 程优选包括如下步骤：将所述的精制纯化样品溶液浓缩，冷冻干燥，即得纯净的丹参酸甲酯 磺酸钠。所述的减压浓缩的压力较佳地为-0. 〇8MPa~-0.1 MPa，所述的减压浓缩的温度较 佳地为30~40°C，所述的真空冷冻干燥较佳地采用上海东富龙科技股份有限公司的LYO-I真空冷冻干燥机进行。
[0041] 本发明中0. 1 %三乙胺-水是指三乙胺的体积分数为0. 1 %的三乙胺水溶液， 0. 1%三乙胺-甲醇是指三乙胺的体积分数为0. 1%的三乙胺甲醇溶液，0. 1%二乙胺-水是 指二乙胺的体积分数为0.1%的二乙胺水溶液，0.1%二乙胺-甲醇是指指二乙胺的体积分 数为0. 1 %的二乙胺甲醇溶液，0. 1 %氨水是指氨的体积分数为0. 1 %的氨水溶液。
[0042] 本发明还提供了上述丹参酸甲酯磺酸钠作为标准品在检测药品中丹参酸甲酯磺 酸钠含量的应用。
[0043] 其中，所述的药品较佳地为丹参酮IIA磺酸钠原料药。
[0044] 其中，所述的应用较佳地包括下述步骤：将丹参酮IIA磺酸钠原料药溶液和丹参 酸甲酯磺酸钠标准品溶液分别进行高效液相色谱检测，根据丹参酸甲酯磺酸钠标准品色谱 图的保留时间确定丹参酮IIA磺酸钠原料药色谱图中相关物质的峰，并根据峰面积计算丹 参酮IIA磺酸钠原料药中丹参酸甲酯磺酸钠的含量。
[0045] 其中，所述的高效液相色谱的条件优选