检测dna甲基化的方法和试剂盒的制作方法

检测dna甲基化的方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及检测DNA甲基化的方法和试剂盒。具体地说，本发明涉及用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测DNA甲基化的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002]DNA甲基化发生在CpG 二核苷酸中胞嘧啶的5’碳原子上，在人类癌症中广泛存在，是表观遗传学的重要研究对象[I]。DNA甲基转移酶(DNMT)负责胞嘧啶的甲基共价修饰
[2]。在DNMT家族中，DNMTl主要负责维持DNA甲基化程度，例如在DNA复制时，对新生DNA链进行甲基化修饰[3] ;DNMT3a和DNMT3b主要负责从无到有的对DNA进行甲基化修饰[4，5]。DNA甲基化的信息在细胞分裂过程中能够稳定的传递，对于器官的发育和行使功能、Z染色体的失活、基因组印记(imprinting)、转座子等的沉默以及基因的适度表达等发挥重要作用[6]。
[0003]在癌细胞中，基因组整体表现出甲基化程度降低的现象[7];而在特定的区域表现出甲基化程度升高，同一些基因的转录沉默相关[8]。DNA甲基化程度已成为新一代的肿瘤标志物，原则上可以用于癌症的早期检测、预后评估、疗效监测等方面[9]。
[0004]在用于研究DNA整体甲基化程度的方法中，高效液相色谱(HPLC)是一种经典的方法[10]，能够进行定量分析，可重复性强。然而这一方法所需的基因组DNA用量比较大，对DNA的质量要求也比较高，不适宜用于高通量分析。也有以亚硫酸氢钠处理为基础的方法，检测重复序列(例如Alu元件或LINE)的含量[11，12]。但是这类方法的操作步骤比较繁琐。

【发明内容】

[0005]本发明采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，对来源于细胞、组织、血清中DNA的整体甲基化程度进行测定，操作简单，重复性好，DNA用量少(可检测至ng级)，定量计算方便，能够实现高通量检测。
[0006]具体的说，本发明涉及一种检测DNA甲基化的方法，其包括:
[0007](I)提取、限制性内切酶处理、纯化基因组DNA ；
[0008](2)将DNA变性后加入封闭液；
[0009](3)用抗甲基胞嘧啶抗体包被ELISA实验板；
[0010](4)弃去包被抗体，在实验板的每个孔中加入封闭液；
[0011 ] (5)弃去封闭液，加入预混的封闭液与DNA样品；
[0012](6)用PBS溶液清洗，干燥后加入抗单链DNA抗体；
[0013](7)用PBS溶液清洗，干燥后加入二抗；
[0014](8)用PBS溶液清洗，干燥后加入TMB底物；
[0015](9)加入硫酸溶液后用酶标仪读数；
[0016](10)根据用基因组DNA标准品制得的标准曲线，计算出样本的相对DNA甲基化程度。
[0017]优选地，在本发明的方法中，所述限制性内切酶是MseI ;所述封闭液是PBS+3%BSA+0.05% Triton X-100 ;所述抗甲基胞嘧啶抗体是Santa Cruz#sc_56615，其浓度是I?10 μ g/mL,优选5 μ g/mL ;所述抗单链DNA抗体是IBL code#18731，其浓度是0.1?I μ g/mL,优选0.5 μ g/mL ;所述二抗是偶联辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)的抗兔源IgG的抗体；所述TMB底物是PIERCE#34028。
[0018]本发明还涉及一种检测DNA甲基化的试剂盒，其包括:
[0019](I)封闭液；
[0020](2)抗甲基胞嘧啶抗体；
[0021 ] (3)抗单链DNA抗体；
[0022](4) 二抗；
[0023](5) TMB 底物；
[0024](6) 2M硫酸；以及
[0025](7) PBS 溶液。
[0026]优选地，在本发明的试剂盒中，所述封闭液是PBS+3% BSA+0.05% Triton X-100 ；所述抗甲基胞啼唆抗体是Santa Cruz#sc_56615,其浓度是I?10 μ g/mL,优选5 μ g/mL ;所述抗单链DNA抗体是IBL code#18731，其浓度是0.1?I μ g/mL,优选0.5 μ g/mL ;所述二抗是偶联辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)的抗兔源IgG的抗体；所述TMB底物是PIERCE#34028。进一步优选地，本发明的试剂盒用于对癌组织进行化疗疗效预测，并且优选用于对血清进行检测。
【附图说明】
[0027]图1显示在来源于不同样本的DNA中，DNA相对甲基化程度与DNA浓度无显著相关性。
[0028]图2显示经甲基转移酶抑制剂处理后DNA相对甲基化程度显著降低。
[0029]图3显示相对甲基化程度测定的饱和曲线。
[0030]图4显示相对甲基化程度测定的标准曲线。
[0031]图5显示肺癌组织相对于癌旁正常组织的DNA相对甲基化程度显著下降(非成对检验)。
[0032]图6显示肺癌组织相对于癌旁正常组织的DNA相对甲基化程度显著下降(成对检验)。
[0033]图7显示肺癌患者癌组织相对甲基化程度随年龄增高而下降。
[0034]图8显示肺癌患者癌组织相对甲基化程度在吸烟患者中有下降趋势。
[0035]图9显示肺癌患者癌组织相对甲基化程度随癌症分期升高而显著下降。
[0036]图10显示肺癌患者(I1、II1、IV期)癌组织相对于正常肺组织的相对甲基化程度的受试者作业特征曲线(ROC)分析。
[0037]图11显示在接受化疗的肺癌患者中，癌组织的相对甲基化程度对患者总体生存率的影响。
[0038]图12显示在甲基化程度高的肺癌患者中，接受化疗与否对患者总体生存率的影响。
[0039]图13显示癌症患者相对于健康对照的血清中DNA相对甲基化程度显著升高。
[0040]图14显示癌症患者血清中DNA相对甲基化程度与年龄无显著相关性。
[0041]图15显示癌症患者血清中DNA相对甲基化程度与性别无显著相关性。
[0042]图16显示健康对照与癌症患者血清中DNA相对甲基化程度比较。
[0043]图17显示癌症患者血清中DNA相对甲基化程度随癌症分期升高而显著上升。
[0044]图18显示癌症患者相对于健康对照的血清中DNA相对甲基化程度的受试者作业特征曲线(ROC)分析。
[0045]图19显示男性癌症患者相对于男性健康对照的血清中DNA相对甲基化程度的受试者作业特征曲线(ROC)分析。
[0046]图20显示女性癌症患者相对于女性健康对照的血清中DNA相对甲基化程度的受试者作业特征曲线(ROC)分析。
【具体实施方式】
[0047]实验步骤
[0048]样品处理:纟目织某因纟目DNA提取俅用QIAanro DNA Mini Kit (Qiagen)。测定浓度后，使用MseI限制性内切酶处理(37°C放置2小时)后使用DNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)纯化DNA。测定DNA浓度后，将DNA稀释至10?50ng/ μ L，95°C变性10分钟，立即冰上放置。取I μ L与49 μ LI X封闭液(PBS+3% BSA+0.05% Triton X-100)混合，冰上放置。
[0049]血清/ 血浆(200 μ L)基因组 DNA 提取使用 QIAamp DNA Blood Kit (Qiagen)，用45 μ L水洗脱。95°C变性10分钟，立即冰上放置。加入5 μ LlOX封闭液混合，冰上放置。
[0050]夹心法酶联免疫吸附测定^LISA)实验步骤:用抗甲基胞嘧啶抗体(SantaCruz#sc-56615,5y g/mL)包被ELISA实验板，每孔加入50 μ L。覆盖平板，4°C过夜放置。次日弃去包被抗体，用 PBS 溶液(0.2g/L KH2PO4, 2.16g/L Na2HPO4.7Η20，0.2g/L KC1，8.0g/LNaCl)洗两遍,每次每孔使用200 μ L,拍干。每孔中加入200 μ L封闭液,室温放置2小时。随后弃去封闭液。每孔加入预混的49 μ L封闭液与I μ LDNA样品。4°C放置至少2小时。使用PBS洗两遍，拍干。将抗单链DNA抗体(IBL code#18731,0.5 μ g/mL)加入96孔ELISA实验板的孔中，每孔加入lOOyL。覆盖平板，室温放置2小时。使用PBS洗四遍，拍干。将二抗(I:4000稀释)加入96孔ELISA实验板的孔中，每孔加入100 μ L0覆盖平板，室温放置I至2小时。使用PBS洗四遍，拍干。每孔加入100 μ LTMB底物溶液(PIERCE#34028)。3?10分钟后，加入2M硫酸溶液，混匀后用酶标仪读数(波长选择为450nm)。
[0051]相对甲基化程度计算:提取人非小细胞肺癌细胞系A549的基因组DNA，MseI酶切处理、纯化后测定DNA浓度，稀释为5、10、20、40即/^14示准品，再按上述步骤进行后续实验。ELISA实验读数后，将标准品和样本吸光度(OD)数据减去不合任何DNA样品的实验孔数据(即去本底)，利用标准品去本底数据作出标准曲线(DNA含量为横坐标，去本底OD值为纵坐标)，将样本的去本底数据代入标准曲线的线性拟合公式中，计算出每个样本中相对DNA甲基化程度。对于组织样本，还需将该数值除以加样DNA含量，计算出每ng组织DNA中的相对甲基化程度。
[0052]实验数据:
[0053]1.选取多个不同的组织样本，测定其DNA浓度，之后测定等体积样本的相对甲基化程度，Pearson相关性系数r为0.1853，P值为0.6084 > 0.05,说明不同样本DNA的相对甲基化程度与其DNA浓度/含量无显著相关性(见图1)。
[0054]2.使用I μ M甲基化酶抑制剂5-氮杂(aza) _2’_脱氧胞苷(DAC)或等体积溶剂二甲基亚砜(DMSO)处理A549细胞2天后，提取细胞DNA测定DNA相对甲基化程度/ng。DAC处理后细胞相对于DMSO处理后细胞的相对甲基化程度显著降低(P = 0.0206)(见图2)。
[0055]3.将A549细胞基因组DNA稀释为不同浓度，加入实验体系中，使最终含量分别为0、4、8、16、32、64、80、120、160、200即，将0嫩含量作为横坐标，测得的相对甲基化程度作为纵坐标作图显示:曲线在10ng前后呈现饱和，而低至4ng依然可以检测出(见图3)。
[0056]4.将A549细胞基因组DNA稀释为不同浓度，加入实验体系中，使最终含量分别为0、4、8、16、32、64、80即，将0嫩含量作为横坐标，测得的相对甲基化程度作为纵坐标，作直线拟合，得到标准曲线。R2 = 0.9929，表明拟合直线的线性关系良好(见图4)。
[0057]5.检测46例肺癌组织样本和46例癌旁正常组织样本DNA的相对甲基化程度/ng，非成对数据检验结果显示癌组织相对于癌旁正常组织DNA相对甲基化程度显著下降(P =0.0263)(见图 5) ο
[0058]6.检测46例肺癌组织样本和各自对应的