人抗凝血酶iii的胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及临床检验领域。具体而言，涉及一种利用胶乳增强免疫比浊方法测定 样本中人抗凝血酶III含量的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 抗凝血酶（Antithrombin)简称AT,血楽源性AT简称为pAT。pAT是体内重要的天 然抗凝蛋白，属于丝氨酸蛋白酶抑制物家族成员。其血楽浓度约为100至150iig/ml(2至 3ymol/L)。pAT由肝脏及血管内皮细胞产生，是一种维生素K依赖的、由432个氨基酸组成 的分子质量为58kDa的单链糖蛋白，含4个N糖基化寡糖链及3个二硫键。根据其135位 的天门冬酰胺是否含糖基可分为含糖基的a异构体及无糖基的P异构体。由于a异构 体135位的糖基可以阻止与肝素的结合，故其与肝素的亲和力小于P异构体。现还通过转 基因绵羊获得了重组抗凝血酶，简称rAT。MasaakiHirose等在中国仓鼠卵巢细胞上表达了 rAT，通过成批发酵使其产量达到lg/L。纯化的rAT具有pAT的特异活性，减少了糖基量，增 强了与肝素的亲和力。
[0003] 抗凝血酶III(AT-III)是作为血液中活性凝血因子的最重要的阻碍因子，它控制 着血液的凝固和纤维蛋白的溶解。血液中抗凝血酶III的水平根据各种疾病、症状而变化。 在弥散性血管内凝血（DIC)、肝疾患、肾病综合征等中降低。血液中的抗凝血酶III水平降 低可能会导致肝素治疗效果无法呈现。因此，掌握抗凝血酶III的活性作为对于此类疾病 的监测、病态分析、预后判定以及肝素治疗或使用抗凝血酶III浓缩制剂投药时的指标具 有重要意义。
[0004] 抗凝血酶III水平增高：可导致出血。可见于先天性凝血因子缺乏，如血友病；后 天性凝血因子缺乏，如急性肝炎、肾移植、使用抗凝药物等。
[0005] 抗凝血酶III水平减低：可导致血栓形成。可见于先天性抗凝血酶III缺乏和功能 异常，如肺梗塞、深部静脉血栓等血栓性疾病；后天性减低，如DIC、慢性肝病、心肌梗塞等。
[0006] 抗凝血酶III的检测方法较多，传统的包括免疫火箭电泳法、凝胶空斑法、发色底 物法等。其中发色底物方法（参见公开号CN102690862A)是目前最常用的方法。但是该方 法需要特殊仪器，且所需时间较长。由于抗凝血酶III在人体内减少时具有重要的临床意 义，因此开发出一种高灵敏度的检测试剂十分有意义。
【发明内容】
[0007] 根据本发明的一些【具体实施方式】，提供了一种人抗凝血酶III的胶乳增强免疫比 浊法检测试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂，其中：
[0008] 第一试剂包含稳定剂、表面活性剂、防腐剂、电解质、促凝剂及缓冲液；
[0009] 第二试剂包含稳定剂、表面活性剂、防腐剂、电解质、包被有抗人抗凝血酶III多 克隆抗体的胶乳颗粒、及缓冲液。
[0010] 在一些实施方案中，本发明的试剂盒还可以根据需要包括校准品。校准品用于标 准曲线的绘制。因此，校准品可以自行配制、也可以使用任何市售校准品。在一些具体实施 方式中，校准品包含防腐剂、电解质、稳定剂、人抗凝血酶III及缓冲液。在一些具体实施方 式中,抗凝血酶III在校准品中的含量在O至lOOOng/ml之间。在一些【具体实施方式】中，抗 凝血酶III源自人的体液并且纯度> 95% ;例如从人体体液中天然提取并纯化获得。
[0011] 在一些【具体实施方式】中，校准品包含四个浓度水平的抗凝血酶III，其中一个浓度 水平不含抗凝血酶III;其余校准品中分别添加有不同含量的抗凝血酶III。在一些具体 实施方式中，校准品包含质量百分比〇. 1至1%的稳定剂、质量百分比〇. 01%至〇. 1%的防 腐剂、质量百分比〇. 1至5. 0%的电解质、10至lOOmmol/L的pH6. 5至8. 0的缓冲液、已知 浓度的人抗凝血酶III以及人血清基质。人血清基质可以合法收集自医疗机构的健康人血 清，经灭活之后去除肝炎、HIV病毒传播风险；也可以是市售人血清基质。
[0012] 在一些实施方案中，抗人抗凝血酶III多克隆抗体源自哺乳动物的IgG抗体，优选 羊IgG抗体、或兔IgG抗体。
[0013] 在一些实施方案中，胶乳颗粒的直径范围为50至250nm、优选100至200nm、更优 选150nm。在一些实施方案中，胶乳颗粒在试剂中的浓度为0. 5至5mg/mL。
[0014] 在一些实施方案中，胶乳颗粒为聚苯乙烯胶乳颗粒。胶乳颗粒表面修饰有官能团， 官能团选自羧基、氨基、羟基、酰肼、氯甲基中的一种；优选羧基。通过这些官能团，将抗体连 接至胶乳颗粒上。在一些实施方案中，采用化学交联法将抗体包被到胶乳颗粒表面，其中所 用的化学交联剂选自：碳二亚胺（EDAC)、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚 胺（Sulfo-NHS)、酰肼、异氰酸酯中的一种或两种；交联缓冲液是不含氨基的缓冲液，选自 MES、M0PS0、MOPS、HEPES、磷酸盐缓冲液中的一种；交联缓冲液的pH在6. 0至8. 0之间。
[0015] 在一些实施方案中，第一试剂和第二试剂中的电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化 镁、硫酸镁中的一种或几种；优选氯化钠。电解质在试剂中的浓度在〇. 1至5. 0%之间。
[0016] 在一些实施方案中，稳定剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、鱼皮明胶蛋白、葡萄糖、果 糖、甘露糖、壳聚糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠中的一种或几种；稳定剂浓度为〇. 1至1%。
[0017] 在一些实施方案中，所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖 钠中的一种，优选PEG-6000 ;促凝剂浓度在2至4%之间。
[0018] 在一些实施方案中，表面活性剂选自吐温、脂肪醇聚乙二醇醚、聚氧乙烯苯基醚、 聚氧乙烯月桂醚中的一种或几种；优选吐温。表面活性剂浓度在质量百分比0. 1至1. 0% 之间。
[0019] 本发明提供一种人抗凝血酶III的胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，其包含第一 试剂、第二试剂和校准品，其中：
[0020] 第一试剂包含：
[0021]
[0022]
[0023] 第二试剂包含：
[0024]
[0025] 包被有抗人抗凝血酶III多克隆抗体的胶乳颗粒，0. 5至5mg/mL，优选lmg/mL;其 中抗人抗凝血酶III多克隆抗体优选0. 6mg/mL,
[0026] 其中胶乳颗粒为粒径150nm的羧基修饰聚苯乙烯胶乳；
[0027] 校准品包含：
[0028]
[0029] 根据本发明的一个具体实施方案，提供了一种人抗凝血酶III的胶乳增强免疫比 浊法检测试剂盒，其包含第一试剂、第二试剂和校准品，其中：
[0030] 第一试剂包含：
[0031]
[0032] 第二试剂包含：
[0033]
[0034] 包被有抗人抗凝血酶III多克隆抗体的胶乳颗粒lmg/mL，其中羊抗人抗凝血酶 III多克隆抗体为0? 6mg/mL，
[0035] 其中胶乳颗粒为粒径150nm的羧基修饰聚苯乙烯胶乳；
[0036] 校准品包含：
[0037]
[0038] 本发明试剂盒，采用胶乳增强免疫比浊法定量检测抗凝血酶III。其原理是：利用 化学交联法将特异性羊抗人抗凝血酶III多克隆抗体包被到胶乳粒子表面，当被测样本中 有抗凝血酶III抗原时发生抗原抗体免疫反应，形成抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，保持反 应体系中抗体过量时，形成的复合物可与邻近的胶乳颗粒连接，最终交织成网状引起反应 体系浊度的显著变化，此时反应体系浊度的变化与被测样本中抗凝血酶III的量成正比关 系，测定此浊度在570nm波长处的吸光度，对照校准曲线即可求出样本中抗凝血酶III的含 量。
[0039] 本发明的试剂盒特异性强、灵敏度高、均一稳定使用简便的特点，适合产业化，便 于临床推广。
【附图说明】
[0040] 图1为本发明试剂盒的灵敏度。
[0041] 图2为本发明试剂盒的线性图。
[0042] ?均值；均值 +2. 6SD; ▲均值-2. 6SD。
[0043] 图3为本发明试剂盒与发色底物方法试剂盒检测临床样本的相关性比较。
【具体实施方式】
[0044] 以下实施例是对本发明的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明 的精神和权利保护范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围内。
[0045] 实施例1:亲和纯化法制备羊抗人抗凝血酶III多克隆抗体
[0046] 具体步骤如下所述：
[0047] (1)每个免疫实验中使用8至10只羊，在免疫开始前，收集动物血清。从这些血清 中纯化的IgG抗体作为对照。
[0048] (2)将0?Img高度纯化的人抗凝血酶III抗原（来自Fitzgerald)溶解在pH7. 8 的磷酸盐缓冲液中，用弗氏完全佐剂乳化，注射到羊的肌肉中，每4周重复注射。在注射起 始后10周，收集血清，并且通过氯化铵沉淀，初步分离来自血清的IgG抗体组分。
[0049] (3)羊抗人抗凝血酶III的多克隆抗体的纯化：
[0050] 制备亲和纯化所用的分离柱：按照产品说明，将IOmg高度纯化的人抗凝血酶III 抗原固定在HITRAPNHS-活性HP