一种基于多孔三氧化钨纳米花构建的真菌毒素传感器的制备方法及应用
【专利说明】 一种基于多孔三氧化钨纳米花构建的真菌毒素传感器的制
备方法及应用
技术领域
[0001]本发明一种多孔三氧化钨纳米花构建的真菌毒素传感器的制备方法及应用。具体是采用具有良好吸附性能和大的比表面积的多孔三氧化钨纳米花，制备一种检测粮食中真菌毒素的传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
【背景技术】
[0002]真菌毒素是真菌产生的次生代谢产物，主要包括黄曲霉毒素、镰刀菌毒素等。最早在11世纪欧洲圣像画中就有关于真菌毒素引起中毒的描述，但直到1960年英国10万多只火鸡因饲用黄曲霉毒素污染的饲料而死亡的事件发生后，真菌毒素才被人们重新认识。受全球气候变暖、干旱等因素的影响，食用和饲用农产品受真菌毒素污染日趋严重，世界各地对于真菌毒素污染的报道日渐增多，有时同一地区可检出多种真菌毒素或同一真菌毒素同时在世界各地被报道。受污染的也不仅限于玉米、小麦、大麦、花生等谷物，亦有干果、水果、中药材、牛奶等。
[0003]目前生物传感器已经广泛用于各种真菌毒素的检测，因为生物传感器具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等一系列优点。其中，由于无标记型传感器可以直接用于检测抗原抗体的识别过程并且避免了标记物带来的干扰，得到了更加广泛的关注。
[0004]本发明将多孔三氧化钨纳米花-天青1-壳聚糖-离子液体水修饰到玻碳电极表面，构建无标记型传感器。第一，多孔三氧化钨纳米花中具有良好的吸附性能，能够有效地负载大量天青I，提供电化学信号；第二，多孔三氧化钨纳米花本身具有大的比表面积，能够有效增加抗体的固定；第三，壳聚糖能够有效的包覆多孔三氧化钨纳米花表面，以防止天青I的泄漏；第四，离子液体能够提高电子在壳聚糖中的电子传递速率，加速天青I和电极表面的电子转移。该方法在检测过程中产生了良好的电化学信号，可用于真菌毒素的分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，为目前有效检测真菌毒素提供了新途径。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是基于多孔三氧化钨纳米花构建无标记型生物传感器。
[0006]本发明的目的之二是将该无标记型生物传感器应用于真菌毒素的高灵敏、特异性检测。
[0007]本发明的技术方案如下
1.一种基于多孔三氧化钨纳米花构建的真菌毒素传感器的制备方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Pm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
(2)在电极表面滴加6μ L浓度为I ~ 2 mg/mL的多孔三氧化钨纳米花-天青1-壳聚糖-离子液体水溶液，干燥；
(3)继续将6μ?浓度为5 ~ 20 Pg/mL的真菌毒素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4 °C冰箱中孵化1 h，清洗干净；
(4)用3yL浓度为5 ~ 20 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4°C冰箱中孵化1 h，清洗干净；
(5)将6μ L浓度为0.0002 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的真菌毒素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4°C冰箱中储存备用。
[0008]多孔三氧化钨纳米花-天青1-壳聚糖-离子液体的制备
将浓度为1 ~ 4 mmol/L的二水合钨酸钠分散在10 mL的乙烯和25 mL的水中，随后加入3 mL浓度为1 ~ 4 mmol/L的盐酸，搅拌30 min后，将上述混合溶液转移到反应釜中，在80°C下反应12 h，离心洗涤后干燥，得到多孔三氧化钨纳米花；
将1 mL的1 ~ 4 mg/mL多孔三氧化妈纳米花水溶液和1 mL的1 ~ 4 mg/mL天青I溶液混合，震荡12 h后离心，加入含有0.4 -1.6 mL的离子液体的浓度为10 mg/mL的壳聚糖溶液，继续震荡1 h，离心后重新分散在1 mL的水中，得到多孔三氧化钨纳米花-天青1-壳聚糖-离子液体水溶液；
所述壳聚糖为羧甲基壳聚糖，所述离子液体为1- 丁基吡啶四氟硼酸盐。
[0009]真菌毒素的检测方法
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
(2)选择差分脉冲伏安法对真菌毒素抗原进行检测，选择在-0.6~ 0 V电压下进行扫描，记录电流变化；
(3)将待测样品溶液代替真菌毒素抗原标准溶液进行检测。
[0010]上述所述真菌毒素选自玉米赤霉稀酮、伏马毒素、T-2毒素、呕吐霉素、赭曲霉毒素和黄曲霉毒素B1。
[0011]本发明的有益成果
(1)本发明采用多孔三氧化钨纳米花具有良好的吸附性能，能够负载大量的天青I。
[0012](2)本发明采用的多孔三氧化钨纳米花具有有大的比表面积，能够有效增加抗体的固定。
[0013](3)本发明采用的壳聚糖能够有效包覆多孔三氧化钨纳米花，防止天青I的泄漏。
[0014](4 )本发明采用的离子液体能够提高电子在壳聚糖中的电子传递速率，加速天青I和电极表面的电子转移。
[0015](5)本发明将制备的无标记型生物传感器用于真菌毒素的检测，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、灵敏和特异性检测。
【具体实施方式】
[0016]实施例1 一种基于多孔三氧化钨纳米花构建的真菌毒素传感器的制备方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干； (2)在电极表面滴加6μ L浓度为I mg/mL的多孔三氧化钨纳米花-天青1-壳聚糖-离子液体水溶液，干燥；
(3)继续将6μ?浓度为5 Pg/mL的真菌毒素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干净；
(4)用3μ L浓度为5 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干净；
(5)将6μ L浓度为0.0002 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的真菌毒素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化I h，清洗干净，于4°C冰箱中储存备用。
[0017]实施例2 —种基于多孔三氧化钨纳米花构建的真菌毒素传感器的制备方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Pm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
(2)在电极表面滴加6μ L浓度为1.5 mg/mL的多孔三氧化钨纳米花-天青1-壳聚糖-离子液体水溶液，干燥；
(3)继续将6PL浓度为10 Pg/mL的真菌毒素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干净；
(4)用3μ L浓度为10 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干净；
(5)将6μ L浓度为0.0002 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的真菌毒素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化I h，清洗干净，于4°C冰箱中储存备用。
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