一种快速检测全血红细胞二十烷三烯酸的方法

文档序号:9488310阅读:1099来源:国知局
一种快速检测全血红细胞二十烷三烯酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域,涉及一种快速检测全血红细胞二十烷三烯酸的方 法。
【背景技术】
[0002] 在人体内,少量脂肪酸以游离形式存在,大部分以结合形式,如甘油三酯、磷脂、糖 脂等存在。从营养学角度,脂肪酸可分为必需脂肪酸和非必需脂肪酸,非必需脂肪酸是指机 体可以自行合成,不必依靠食物供应的脂肪酸;必需脂肪酸是指人体维持机体正常代谢不 可缺少而自身又不能合成或合成速度慢,无法满足机体需要,必须通过食物供给的脂肪酸。 必需脂肪酸可分为ω(Omega)-6系列脂肪酸和ω(Omega)-3系列脂肪酸。膳食中必需 脂肪酸缺乏将导致皮肤病变、神经和视觉疑难症、心脏疾病等问题。
[0003] 由于红细胞膜上脂肪酸的组成能够反映人群的长期饮食结构,而不会受到短期内 饮食的影响。因此,测定人全血红细胞脂肪酸,能够准确、客观的反映机体内不同脂肪酸的 营养水平。
[0004] 国内外有关脂肪酸检测的相关报道盛多,涉及到食品、环境、医药卫生、临床应用 等多个领域,检测方法包括气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-串联 质谱法(LC-MS/MS),检测样本类型更是涉及食物、水质、药品、血液、组织等。但是,不同的应 用领域及不同的样品类型,所涉及的样品处理与脂肪酸检测分析流程千差万别,因此不同 领域以及不同样品类型的脂肪酸检测方法之间无可比性。
[0005] 目前,全血红细胞脂肪酸的检测主要有GC、GC-MS和LC-MS/MS三种。GC是目前 红细胞脂肪酸检测的常用方法,但是此方法的检测器对未实现色谱分离的类似脂肪酸,无 法实现准确定性分离和定量分析,因此无法对多种脂肪酸特异性、准确的定性和定量分析。 LC-MS/MS方法前处理较为复杂,且分析结果重现性较差。而GC-MS方法由于同时具有气相 的分离功能和质谱的特异性定性、定量功能,所以可以解决GC和LC-MS/MS的弊端,但是现 有的GC-MS方法分析时间较长,检测通量较低。
[0006] 中国专利201210247480. 2公开了一种气相色谱-质谱联用检测脂肪酸含量的方 法,该方法针对的样品为动物组织,样品的前处理包括皂化步骤,还需要充氮气保护,样品 的前处理复杂。 因此,本领域技术人员迫切需要一种前处理简单、检测快速、方法灵敏度高、特异性强 的适用于全血红细胞脂肪酸的检测方法。

【发明内容】

[0007] 为了解决现有技术中存在的问题,本发明提供一种快速检测全血红细胞二十烷三 烯酸的方法,该方法的样品用量少,前处理简单,灵敏度高,特异性强,定性、定量功能强大, 并且整个检测过程时间短、检测通量高。本发明仅涉及全血样本红细胞二十烷三烯酸的检 测。
[0008] -种快速检测全血红细胞二十烷三烯酸的方法,包括如下步骤: A) 全血样品的前处理:从全血样品中分离红细胞,加入内标溶液和盐酸-甲醇溶液进 行衍生化反应,然后加入萃取剂萃取,取上清液并氮气吹干,残渣中加入复溶剂,混匀,得到 样品检测液; B) 对所述样品检测液采用气相色谱-质谱仪进行检测,气相色谱条件包括:色谱柱采 用极性色谱柱,载气为氦气,不分流进样,线速度流量控制方式,载气流量为0. 80~1.OOmL/ min,起始柱温60°C,先升温至180°C,然后升温至220°C,整个升温程序的梯度时间为 8~15min;质谱条件为:采用电子轰击离子源,采用全扫描和选择离子扫描方式。
[0009] 采用上述技术方案,前处理简单,通过萃取-吹干-复溶的过程,有效去除了干扰 物质,使红细胞中的二十烷三烯酸转化为挥发性较强、适用于气相色谱质谱仪检测的二十 烷三烯酸甲酯产物;检测方法的灵敏度高,特异性强,定性、定量功能强大,准确性好,并且 整个检测过程时间短、检测通量高。
[0010] 优选地,所述内标溶液选自十七烷酸。除十七烷酸,外本发明还可以选用十五烷酸 或十九烷酸作为内标溶液。
[0011] 优选地,所述萃取剂选自正己烷,所述复溶剂选自正己烷。使用正己烷作为萃取 剂,可以将各种脂肪酸的甲酯化产物萃取出来,萃取效率高且有效避免了其他物质的干扰。
[0012] 优选地,所述内标溶液与红细胞的体积比为1 : (1~2);所述红细胞、盐酸-甲醇溶 液、萃取剂及复溶剂的体积比为1 :(1〇~25) :(20~50) :(4~10)。
[0013] 优选地,所述红细胞、盐酸-甲醇溶液、萃取剂及复溶剂的体积比为1 :20 :40 :8。
[0014] 优选地,所述极性色谱柱选自规格为20m*0. 20μm的极性毛细管色谱柱。
[0015] 优选地,所述气相色谱条件还包括:进样体积为WL,进样口温度为220~230°C, 后运行温度为240~250 °C,后运行时间为2min,吹扫流量为3. 0~5.OmL/min,总流量为 50. 0~60· 0mL/min,平均线速度为 35. 0~45·Ocm/s。
[0016] 优选地,所述质谱条件还包括:接口温度为210~230°C;离子源温度为220~240°C; 四极杆温度为140~160°C,溶剂延迟时间为3. 0~4.Omin,全扫描范围为m/z60. 00~450. 00。
[0017] 优选地,所述检测方法还包括如下步骤:检测结果的定性判断和/或定量计算。
[0018]与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明提供的检测方法可以实现全血样 品红细胞中二十烷三烯酸的定性和定量检测,具有前处理简单,有效去除了干扰物质,灵敏 度高,特异性强,定性、定量功能强大,准确性好,并且整个检测过程时间短、检测通量高。
[0019] 本发明采用全扫描和选择离子扫描同时进行的扫描模式,能够得到样品的总离子 流色谱图和选择离子色谱图,总离子流色谱图可以用于对化合物进行定性,用于检测过程 中监测出峰时间处的化合物是否为目标化合物,以免出现其他干扰。此外,选择离子扫描对 每个化合物的特征离子进行扫描,解决了单独使用气相色谱对脂肪酸进行定量不够准确的 问题,进一步提高了检测准确度和方法的特异性。本发明所使用的极性色谱柱适合二十烷 三烯酸的分离分析,色谱柱的高柱效以及低流失,大大降低了质谱检测时的背景干扰,最低 检出限达到了 〇.〇lmg/L,检测灵敏度高。按本发明提供的检测方法,单个样品检测时间为 12min,与现有传统方法相比,检测时间短,仪器检测通量高。
【附图说明】
[0020] 图1二十烷三烯酸甲酯的标准曲线。
[0021] 图2全血红细胞样品中脂肪酸甲酯的总离子流色谱图。
[0022] 图3全血红细胞样品中二十烷三烯酸甲酯的选择离子色谱图。
[0023] 图4全血红细胞样品中十七烷酸甲酯的选择离子色谱图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0025] 实施例一全血样品的前处理 将抗凝全血样本混匀,离心,弃除上层血浆、白细胞、血小板等;向剩余红细胞中加入等 体积的生理盐水,混
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