富集tdh致病性副溶血性弧菌免疫磁珠制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种病原菌免疫磁珠的制备和应用，特别涉及用于富集产耐热直接溶 血素（TDH)的致病性副溶血性弧菌的免疫磁珠的制备方法及应用，它是以磁珠为载体，免疫 兔子制备的多克隆抗体为中间识别体，经过偶联-洗涤的过程制备出免疫磁珠，在合适的 条件下可以高效捕获产TDH的致病性副溶血性弧菌，可广泛应用于环境及进出口食品检验 中致病性副溶血性弧菌的富集分离与检测。
【背景技术】
[0002] 副溶血性弧菌是引起世界上很多国家尤其是沿海地区食源性疾病的重要病原菌， 其广泛存在于近海岸的海水、海底沉积物和鱼虾类、贝类。其引起的食物中毒症状主要是以 腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热等为主的急性胃肠炎。目前，由副溶血性弧菌引起的临床病例 已在数量上超过沙门氏菌引起的临床病例，成为我国首要的食源性病原菌，特别是一些沿 海城市，由该菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的比例尚达60%以上。
[0003] 研究显示只有携带毒力因子的菌株才具有致病性。但是大量研究表明，几乎所有 从海水和水产品中分离的副溶血性弧菌是不产毒的菌株，虽然此类菌株也有引起食物中毒 的报道，但绝大部分是不致病的。而且随着检测技术的发展和应用证实，致病性副溶血性弧 菌的确在环境及食品中的含量较低，致病性菌株和非致病性菌株差异悬殊的混合分布于沿 岸海水、海河交界处及海产品中，致病性菌株仅占1/100-1/1000。利用传统的平板分离方法 从环境及食品中分离的副溶血弧菌大多数为非致病性菌株，很难分离到致病性菌株。但是 临床病人中分离的副溶血性弧菌超过90%都是致病性菌株。
[0004] 不针对致病性副溶血性弧菌的监测就不能有效预警和控制食物中毒的发生。 1997年在美国的太平洋西北岸以及 1998年在美国的牡蛎海湾都发生了因食用牡蛎所致 的副溶血性弧菌暴发病例，流行病学调查表明食用的样品中检测到的副溶血性弧菌总数 小于200cfu/g，按照FDA标准这个结果远远低于IX104cfu/g，属于"正常的合格样品"。 Kara-Kudo等人的研究也证实海产品中总的副溶血性弧菌的量并不能正确反映致病性副溶 血性弧菌的情况，致病性副溶血性弧菌的量与较高的总的副溶血性弧菌的量之间并没有直 接关系，因为在检测到的TDH阳性的样品中，其总的副洛血性弧囷的量小于1X104cfu/g，这 提示，总的副溶血性弧菌并不是预测致病性副溶血性弧菌的一个可靠的指标[5]。因此，建立 针对致病性副溶血性弧菌的检测方法对于预防和控制食源性疾病有重要的意义。
[0005] 分子流行病学研究发现，致病性副溶血性弧菌中主要毒力因子是耐热直接溶血素 (TDH)，超过90%的致病性菌株携带TDH，只有很少致病性菌株携带耐热直接溶血素相关溶 血素（TRH)，因此通常将TDH作为鉴定致病性副溶血性弧菌的标记。目前，用于致病性副溶 血性弧菌检测的方法主要是分子检测，比较常见的有常规PCR，实时荧光PCR以及基因芯 片，这些检测方法具有高灵敏度，操作简单，高特异性和高通量等优点，但是这些方法只能 对其进行定性分析，不能做到分离致病性副溶血性弧菌，不利于对其的深入研究。
[0006] 本研究即在此基础上，表达纯化毒力因子TDH，制备多克隆抗体，免疫磁珠，富集携 带TDH的副溶血性弧菌。
【发明内容】
[0007] 本发明旨在提供一种富集TDH致病性副溶血性弧菌免疫磁珠制备方法及应用。主 要解决目前检测方法只能对其进行定性分析，不能做到分离致病性副溶血性弧菌的技术问 题。本发明的思路是：利用产耐热直接溶血素副溶血性弧菌中毒力因子TDH作为抗原制备 多克隆抗体，后者结合免疫磁珠对食品目的菌进行富集，然后利用弧菌显色平板进行分离， 从而达到有针对性的检测食品中产耐热直接溶血素副溶血性弧菌的目的。
[0008] 实现本发明的技术方案是：一种富集TDH致病性副溶血性弧菌免疫磁珠制备方 法，包括以下步骤：通过表达纯化副溶血性弧菌中毒力因子TDH，将其免疫大白兔，获得多 克隆抗体，然后将多克隆抗体偶联在磁珠上，获得结合标记二抗的免疫磁珠，然后直接捕获 食品中产耐热直接溶血素副溶血性弧菌。
[0009] 具体步骤如下： ①毒力因子TDH的表达纯化： 根据网上公布的副溶血性弧菌RMD2210633菌株的全基因组序列，利用软件01ig〇6. 0 设计毒力因子TDH的表达用引物，并根据需要加入克隆所需要的酶切位点和保护碱基。引 物为：FP~CGGGATCCATGAAGTACCGATATTTTGC：RP-CCCAAGCTTTTATTGTTGATGTTTAC〇 经PCR扩 增，克隆入表达质粒pET-30a，建立重组质粒，将其转入表达菌BL21中，经诱导表达后超生 离心，上清用HisBindPurificationKit(Novagen公司）纯化重组蛋白。
[0010] ②多克隆抗体的制备： 用获得的重组蛋白皮下多点注射成年新西兰兔，第一次剂量为lmg/只。第14天，进行 第二次免疫，剂量为〇. 5mg/只。第28天，进行第三次免疫，剂量为0. 5mg/只。第35天进 行第四次免疫，剂量为〇. 5mg/只，之后再每隔一周免疫一次，共免疫7次。免疫完后，进行 兔血的纯化。将纯化好的兔血分装，于_20°C冻存备用。
[0011] ③免疫磁珠的制备： 免疫磁珠的制备按照磁珠说明书进行。取100μ1磁珠悬浮液(含磁珠约lmg)至离心 管内，将离心管放于磁力架上，待上层液体变澄清后，保留底部的磁珠，弃掉上清，加lml磁 珠偶联缓冲液，重悬磁珠后，磁力条件下将磁珠沉淀；先后加入1〇〇μ1磁珠偶联缓冲液和 2μ1抗体(含抗体约7μg)混勾，孵育30min，磁力将磁珠沉淀，弃上清；加入lml洗液，磁力 将磁珠沉淀；重复此步骤3次；最后加入100μ1洗液，重选磁珠，放于4°C冰箱备用。
[0012] 本发明优点是：1表达纯化副溶血性弧菌中主要的毒力因子TDH，将其作为抗原， 制备多克隆抗体，保证分离的高度特异性，这是常规培养分离方法所不及的；2利用免疫磁 珠捕获技术可快速收集，浓缩环境及食品中的目的菌，操作简便，快速。
【附图说明】
[0013] 图1为免疫磁珠捕获产耐热直接溶血素副溶血性弧菌实验中抗原抗体优化组合 实验结果。
[0014] 图2为免疫磁珠捕获产耐热直接溶血素副溶血性弧菌的特异性实验结果。
[0015] 图3为未经免疫磁珠捕获水产品样品中产耐热直接溶血素副溶血性弧菌实验结 果。
[0016] 图4为经免疫磁珠捕获水产品样品中产耐热直接溶血素副溶血性弧菌实验结果。
【具体实施方式】
[0017] 富集TDH致病性副溶血性弧菌免疫磁珠制备方法，包括以下步骤： ①毒力因子TDH的表达纯化： 根据网上公布的副溶血性弧菌RMD2210633菌株的全基因组序列，利用软件01ig〇6. 0设计毒力因子TDH的表达用引物，并根据需要加入克隆所需要的酶切位点和保护碱基。引 物为：FP~CGGGATCCATGAAGTACCGATATTTTGC：RP-CCCAAGC