用于分析血液以检测与异常蛋白质聚集相关的疾病的方法
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2013年03月15日提交的美国专利申请第13/833008号的优先权， 其内容以引用方式全文并入于此作为参考。
技术领域
[0003] 本公开涉及用于分析血液以检测与异常蛋白质聚集相关的疾病的方法。在一个实 施方案中，所述与异常蛋白质聚集相关的疾病是阿尔茨海默氏病。
【背景技术】
[0004] 阿尔茨海默氏病（AD)是老年人口痴呆的最常见原因，全世界超过3500万人受到 影响，且若不开发出有效的疗法，到2050年受影响人口预计将上升至1亿1500万（Barnes 和Yaffe2011)。这种年龄相关的神经变性病症以淀粉样蛋白β(Αβ)(包括脑中的老年斑 块、神经原纤维缠结和突触丢失）为病理特征（Selkoe2001)。虽然AD是一种变性病症是 明确的，但免疫系统的作用也是突出的（由Britschgi和Wyss-Coray综述，2007)。在AD 中，有毒的Αβ肽聚集成更高分子量的组装体，且不仅在细胞外间隙，也在脑中的血管壁上 蓄积（delaTorre2002;Deane与Zlokovic2007)，增加它们的通透性（Nagababu等人， 2009)，并促进将T淋巴细胞转运至脑中（Farkas等人，2003)。巨噬细胞/小神经胶质细胞 吸收Αβ，且为Αβ清除的关键因素（Majumdar等人，2008;Mildner等人，2007;Simard等 人，2006)。嗜中性粒细胞也通过血脑屏障破坏渗入AD脑中（Stamatovic等人，2005)。
[0005] 尽管付出了相当大的努力，但是既没有对于AD的治疗，甚至也没有用于可靠地建 立确定的诊断的临床试验；脑组织的死后检查是目前确认AD诊断的唯一确定方法。实际 上，目前的诊断标准将"可能的AD"作为具有最高确定度的类别（McKhann等人，2011)，这反 映出死后诊断的局限。简单和可靠的试验基于下述几个原因将会是重要的：如果入组的个 体具有明确的诊断，治疗性试验将会更可靠，使得能够研究更多的同质群体。一旦这个成为 可能，较轻的痴呆（轻度认知缺损）病例（其还未达到对于AD的诊断标准），能被正确地分 类为其他原因（例如，血管的）的早期AD，使合适的治疗能得到更好的预测及建立。
[0006] 从人口健康角度，考虑到AD脑中的生物化学变化（例如淀粉样蛋白沉积）开始于 出现临床症状的几年前到也许数十年前，当可行时，检测早期临床前疾病并建立预防措施 是可能的。因此，随着发达国家准备开始应对AD不可避免的流行，对于AD便宜的、非侵入 性的及快速的检验是至关重要的。
[0007] 对于发展生物标记以支持AD诊断，人们已做出了大量的努力。在血液中，焦点集 中于测定血浆中的Αβ水平。这并未被证实是可靠的，因为Αβ40、Αβ42的水平或二者的 比率不能可靠地区分健康对照和AD患者（Thambisety与Lovestone2010)。其他方式包括 血浆的蛋白质组学分析，但是它是昂贵的、复杂的，无法经受高通量分析的考验且仍需实验 的。Αβ的CSF分析及（磷酸化的）微观相关（tau)水平具有更强的预测价值（vanRossum 等人，2012 ;Senanaron等人，2012)，但与血液相比其是侵入性的，不太可能成为正式研究 试验外的常规方法。成像标记〇\?14]\?1、？06^^1'、淀粉样蛋白^^1')(拓〇1^2012 ;]\&^811(^ 和Imabayashi2012)全都更昂贵，不是普遍可用的，且要么是非特异的（MRI)要么是高度 专业化的，只在几个中枢（center)可用（例如，淀粉样蛋白-PET)。因此，用于诊断AD和将 发展为AD的AD相关的轻度认知缺损的简单且便宜的血液检测是高度值得期望的。人血小 样品中进行检测的能力将是对目前方法的巨大改进，并为发展简单、快速高通量筛选方法 铺平道路。这样的方法也适用于于其他以异常蛋白质聚集为特征的疾病。
【发明内容】
[0008] 发明人描述了用于分析血液以检测与异常蛋白质聚集相关疾病的新方法。如实施 例中所述，发明人已确认在非血浆血液成分（例如循环血白细胞和血小板）中检测与疾病 相关的致病蛋白质聚集物是可能的，所述疾病包括但不限于：阿尔茨海默氏病、牛海绵样脑 病（BSE)和外伤性脑损伤。此外，带有结合至致病蛋白质聚集物的荧光探针的波谱荧光技 术的使用已被证明能够容易地区分健康对照的血样和患有与异常蛋白聚集相关的疾病的 个体的血样。因而，以结合至致病蛋白质聚集物的荧光探针对非血浆血液成分进行的波谱 分析使中枢神经中通常与异常蛋白质聚集相关的疾病的检出成为可能。使用转基因动物模 型，也表明在此所述的方法能够在脑样品中观察到病状的同时，在疾病进展时尽早使用血 样识别患有阿尔茨海默氏病的个体。
[0009] 因此，本公开涉及一种检测个体中与异常蛋白聚集相关的疾病的方法。在一个实 施方案中，所述方法包括（a)将来自个体的非血浆血液成分与结合至致病蛋白质聚集体的 探针接触，及（b)检测结合至致病蛋白质聚集体的探针，其中所述非血浆血液成分中致病 蛋白质聚集体的存在表明所述个体患有与异常蛋白质聚集相关的疾病。
[0010] 本公开也涉及一种用于检测来自个体的血样中的致病蛋白质聚集体的体外方法。 在一个实施方案中，所述方法包括（a)将来自血样的非血液成分与结合至致病蛋白质聚集 体的探针接触，及（b)检测所述结合至致病蛋白质聚集体的探针。
[0011] 在一个实施方案中，在此所述的方法包括从个体中获取血样以及先从所述血样中 分离出一种或多种非血浆血液成分，再将所述非血浆血液成分与结合至致病蛋白质聚集体 的探针接触。在一个实施方案中，所述非血浆血液成分选自红细胞、白细胞、微泡和血小板。 在一个优选的实施方案中，所述非血浆血液成分是白细胞。在一个实施方案中，在此所述的 方法包括从个体中获取血样，以及先从所述血样中分离血沉棕黄色层，再将所述血沉棕黄 层与结合至致病蛋白质聚集体的探针接触。
[0012] 在一个实施方案中，在此所述的方法包括从个体中获取血样，以及先从所述血样 中分离白细胞，再将所述白细胞与结合至致病蛋白质聚集体的探针接触。
[0013] 在另一实施方案中，在此所述的方法包括从个体中获取包含血沉棕黄层的血样， 再将所述血沉棕黄层的白细胞与结合至致病蛋白质聚集体的探针接触。
[0014] 在另一实施方案中，所述探针是荧光探针，任选构象敏感的探针。任选地，所述 探针是刚果红、刚果红衍生物、K114、X34、BSB、FSB、頂SB、柯胺-G(Chrysamine-G)、甲氧 基-X34、甲氧基-X04、硫磺素-T、硫磺素-S、匹兹堡化合物B(PittsburghcompoundB)、噻 嗪红R、金胺-0、P-FTAA或与p-FTAA有关的发光共辄聚噻吩（LCP)或发光共辄寡聚噻吩 (LC0)〇
[0015] 在一个实施方案中，所述探针包含选择性地结合至致病蛋白质聚集体的抗体。任 选地，所述抗体由以可检测的标记物（例如荧光标记物）标记。在一个实施方案中，所述探 针是抗淀粉样蛋白抗体。在一个实施方案中，所述探针是抗-微管相关或抗-高度磷 酸化的微管相关抗体。
[0016] 在另一实施方案中，检测结合至致病蛋白质聚集体的探针包括检测结合至致病蛋 白质聚集体的探针的荧光或吸光度。
[0017] 在另一实施方案中，检测所述探针的荧光或吸光度包括检测荧光信号强度、产生 荧光发射光谱和/或产生吸收光谱。在一个实施方案中，检测结合至致病蛋白质聚集体的 探针的荧光包括检测两个或更多个波长下的荧光信号的强度或两个多个波长下结合至致 病蛋白质聚集体的探针的吸光度。
[0018] 在另一实施方案中，所述方法进一步包含将与非血浆血液成分接触的探针的荧光 或吸光度和与参比非血浆血液成分接触的参比探针的荧光或吸光度比较。任选地，所述参 比非血浆血液成分来自于患有与异常蛋白质聚集相关的疾病的参比个体，个体非血浆血液 成分的荧光或吸光度与参比非血浆血液成分的荧光或吸光度间的一致性表明了所述个体 患有与异常蛋白质聚集相关的疾病。
[0019] 在另一实施方案中，检测所述探针的荧光或吸光度包括检测两个或更多个波长下 的荧光发射信号强度，产生包含两个或更多个波长下的测量的荧光发射光谱，或产生包含 两个或更多个波长下测量的吸收光谱。
[0020] 在另一实施方案中，所述方法进一步包括将所述荧光发射光谱与一种或多种参比 荧光发射光谱比较。任选地，至少一个参比发射光谱是来自患有与异常蛋白质聚集相关的 疾病的参比个体的参比非血浆血液成分的荧光发射光谱。所述荧光发射光谱和至少一个参 比荧光发射光谱间的一致性表明了所述个体患有与异常蛋白质聚集相关的疾病。可选择 地，至少一个参比发射光谱是来自于健康对照参比个体（例如未患有与异常蛋白质聚集相 关的疾病的个体）的参比非血浆血液成分的荧光发射光谱，所述荧光发射光谱与至少一个 参比荧光光谱间的一致性表明了所述个体未患有与异常蛋白质聚集相关的疾病。任选地， 所述参比发射光谱包含非神经性疾病对照。
[0021] 在另一实施方案中，所述方法进一步包括将所述吸收光谱与一个或多种参比吸收 光谱比较。任选地，至少一个参比吸收光谱是来自患有与异常蛋白质聚集相关的疾病的参 比个体的参比非血浆血液成分的吸收光谱，所述吸收光谱与至少一个参比吸收光谱间的一 致性表明了所述个体患有与异常蛋白质聚集相关的疾病。可选择地，至少一个参比吸收光 谱是来自健康对照参比个体（例如未患有与异常蛋白质聚集相关的疾病的个体）的参比非 血浆血液成分的吸收光谱，所述吸收光谱与至少一个参比吸收光谱间的一致性表明了所述 个体未患有与异常蛋白质聚集相关的疾病。
[0022] 本领域普通技术人员将理解在一些实施方案中，个体非血浆血液成分的荧光光谱 或吸收光谱的荧光或吸光度与参比非血衆血液成分的荧光光谱或吸收光谱的荧光或吸光 度的差异或相似点可表明所述个体患有或未患有与异常蛋白聚集相关的疾病，这取决于所 述参比非血浆血液成分的疾病状态。相似地，个体非血浆血液成分的荧光光谱或吸收光谱 与参比非血浆血液成分的荧光光谱或吸收光谱的差异或相似点可表明所述样品具有致病 蛋白质聚集体或不具有致病蛋白质聚集体，这取决于所述参比非血浆血样是否具有致病蛋 白质聚集体。
[0023] 在另一实施方案中，所述方法包括将荧光发射光谱或吸收光谱与多个参比光谱相 比较。例如，在一个实施方案中，使用两个或更多个不同的激发波长产生两个或更多个荧光 发射光谱，并将其与使用相同或相似的激发波长所产生的两个或更多个参比光谱比较。
[0024] 在另一实施方案中，所述方法进一步包括：
[0025] (a)产生荧光发射光谱或吸收光谱；
[0026] (b)进行光谱分解以确定对荧光发射光谱或吸收光谱有贡献的单个基础光谱的权 重；并
[0027] (c)使用所述权重确定个体患有与异常蛋白质聚集相关的疾病的可能性或使用所 述权重确定样品具有致病蛋白质聚集体的可能性。
[0028] 在另一实施方案中，所述单个基础光谱确定于（a)已知患有与异常蛋白质聚集相 关的疾病的个体的样品，（b)健康对照个体的样品和/或（c)未与探针接触的样品。在一个 实施方案中，所述样品是已知具有或不具有特定的致病蛋白质聚集体的非血浆血液成分。
[0029] 可使用本领域已知的不同的方法进行光谱分解，以确定单个基础光谱的权重。例 如，在一个实施方案中，使用线性代数法进行光谱分解。在一个实施方案中，使用非线性代 数法进行光谱分解。在另一实施方案中，使用Levenberg-Marquardt算法进行光谱分解。
[0030] 也可使用本领域已知的不同的方法将荧光发射光谱或吸收光谱与一种或多种参 比波谱进行比较，以确定所述波谱间的一致性，或确定所述波谱间的差异或相似点。在一个 实施方案中，合适的方法产生波谱间相似处或差异的定量测量。在一个实施方案中，在此所 描述的方法进一步包括生成统计测量或可能性评分，即波谱或波谱集表明与异常蛋白质聚 集相关的疾病的存在或致病蛋白质聚集体的存在。例如，在一个实施方案中，可使用机器学 习（machinelearning)、遗传算法或主成分分析用于比较波谱或波谱集。
[0031] 在另一实施方案中，所述与异常蛋白质聚集相关的疾病选自由下述疾病组成的 组：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏症、轻度认知缺损、大脑淀粉样血管病、肌病、神 经病、脑外伤、额颞痴呆、皮克氏病、多发性硬化、朊病毒病、唐氏综合征和ALS。
[0032] 在另一实施方案中，所述致病蛋白质聚集体包括淀粉样蛋白、任选地为淀粉 样蛋白、α-突触核蛋白、亨廷顿蛋白（huntingtin)、微管相关蛋白（tauprotein)、高度磷 酸化的微管相关蛋白（pTau)、H元病毒蛋白、αΒ_晶状体蛋白（CRYAB)、结蛋白、砸蛋白、肌动 蛋白、肌球蛋白和/或超氧化物歧化酶（S0D)。
[0033] 在另一实施方案中，所述致病蛋白质聚集体包括β-淀粉样蛋白，所述疾病是阿 尔茨海默氏病。
[0034] 在另一实施方案中，将来自个体的白细胞与结合至致病蛋白质聚集体的探针接触 的步骤在碱性pH下进行。例如，在一个实施方案中，所述pH高于9、高于10或高于11。在 一个实施方案中，所述pH任选地为约10. 5。在另一实施方案中，将来自个体的白细胞与结 合至致病蛋白质聚集体的探针接触的步骤在酸性pH下进行，任选地pH低于6、低于5或低 于4。
[0035] 在另一实施方案中，在此所描述的方法包括使用多个不同的激发波长产生多个荧 光测量值或多个荧光光谱。例如，在一个实施方案中，所述方法包括在两个或更多个激发波 长下生成两个或更多个荧光发射光谱。在一个实施方案中，所述方法包括在三、四、五、六、 七、八、九、十或多于十个的激发波长下分别生成三、四、五、六、七、八、九、十或高于十个焚 光发射光谱。不限制于任何的理论，变化激发波长和分析两个或更多个荧光光谱被认为增 加用于血液中致病蛋白质聚集体检测的在此所述方法的灵敏度和/或特异性。
[0036] 在另一实施方案中，至少一个激发波长在近紫外区内，任选约200nm至约400nm。 在一个实施方案中，至少一个激发波长为约300nm至约500nm，任选约375nm或约445nm。在 另一实施方案中，所述激发波长与固定半导体激光二极管的标准波长一致。在一个实施方 案中，所述激发波长包括一种或多种选自约375nm、约405nm、约445nm和约457nm的波长。 在一个实施方案中，至少一个激发波长在约200nm和2000nm之间。
[0037] 在另一实施方案中，通过测量多个波长下的荧光或吸光度强度产生荧光发射光谱 或吸收光谱。在一个实施方案中，通过从约400nm至约700nm或从约200nm至约2000nm进 行测量生成波谱。
[0038] 在另一实施方案中，将结合至致病蛋白质聚集体的探针的荧光或吸光度归一化为 细胞计数。在一个实施方案中，将结合至致病蛋白质聚集体的探针的荧光或吸光度归一化 为用于测量荧光或吸光度（例如在光路内或成像场内）的样品中的细胞计数。用于确定细 胞计数的本领域已知的不同方法包括例如通过使用荧光团（例如DR