一种单细胞透射电镜制样方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种透射电镜(Transmiss1nElectron Microscopy,即 TEM)超薄切片样品的制备方法，尤其是涉及一种单细胞透射电镜制样方法。
【背景技术】
[0002]随着精准医学的发展，观察和了解单一个细胞生理和病理状态下各种细胞器的超微形态结构，对基础医学研究和临床病理诊断具有重要意义。目前对动物细胞的结构观察中，光学显微镜和电子显微镜是必不可少的工具，光镜观察显示的结构图像，受限于其放大倍数，结构信息十分有限；透射电镜可观察细胞超微结构(隋淑光.用电镜半薄切片技术制备光镜连续观察样品的实验[J].生物学教学，2011，36(7):58.)。故而，透射电子显微镜是研究生物超微结构的重要工具(A Filtrat1n Based Technique for Simultaneous SEMand TEM Sample Preparat1n for the Rapid Detect1n of Pathogens[J].Viruses-Basel, 2014,6(9):3458-3471)。对于生物样品而言，TEM样品的制备对于TEM观察至关重要，常规超薄切片技术的制样过程一般包括为固定、清洗、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤(Use of permanent marker to deposit a protect1n layer against FIB damage inTEM specimen preparat1n[J].J Microsc, 2014, 255(3):180-187) 0
[0003]常规超薄切片技术的制样对的生物样品有一定的体积要求，一般是肉眼可见，否则在繁琐的制样过程中难以操作。单一个细胞体积小且颜色不显眼。而在科研和医疗实践中会遇到受限于客观实际，只能获得一个细胞，比如人卵细胞；或科研实际需要，只了解某一个细胞的超微结构变化。而常规的常规超薄切片技术的制样无法满足单细胞制样的要求；针对单细胞透射电镜制样，目前尚无较好的解决方案。因此如何制备高质量的单个细胞透射电镜超薄切片是困扰生物医学电镜从业者的一个难题。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种能满足单个细胞透射电镜样品制备要求，进而能对单个细胞的超微结构进行研究和病理诊断分析的单细胞透射电镜制样方法。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供的单细胞透射电镜制样方法，包括以下步骤:
[0006](I)、在体视显微镜下，将单细胞置于装有5-20微升体积浓度为2.5%的戊二醛的0.2mlEP管中，4°C固定30-60分钟；
[0007](2)、准备一张干净的载玻片，用免疫组化笔在玻片中间画一个直径0.5-1.5cm的圆圈，干燥10-15秒，之后将上述包含有单个细胞的液体转移到圆圈正中间；在体视显微镜下检查单细胞是否在载玻片上；
[0008](3)、置于室温或37°C烤箱中，让液体刚好蒸发完，在体视显微镜镜下，及时加5-10微升甲苯胺蓝染液(Toluidine Blue,质量百分浓度I %，PBS配制)，染色1-3分钟后，用0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS)轻轻洗去染液；
[0009](4)、将载玻片置于冰上，滴加30-60微升融化的质量百分浓度2%琼脂，冷却至50-6(TC后再加，以免损伤细胞形态，进行预包埋；
[0010](5)、待琼脂完全凝固后，将包含有单个细胞的琼脂块转移至常规透射电镜制样装置中；用0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗液漂洗3次，每次10-15分钟；
[0011](6)、后固定:用质量百分浓度I %锇酸固定液固定40-60分钟，然后用0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗液漂洗3次，每次10-15分钟；
[0012](7)、脱水:采用梯度丙酮系列脱水法脱水；
[0013]30%丙酮 10-15 分钟，
[0014]50%丙酮 10-15 分钟，
[0015]70%丙酮 10-15 分钟，
[0016]90%丙酮 10-15 分钟，
[0017]100%丙酮10-15分钟，两次；
[0018](8)、树脂浸透:
[0019]用体积比为1:1的纯丙酮和Epon812包埋液的混合液浸泡单个细胞样品，置于37°C烤箱内6-12小时；再用Epon812包埋液纯包埋液置于37°C烤箱内浸透6_12小时；
[0020](9)、包埋和固化:
[0021]将Epon812包埋液倒入包埋板孔中，迅速将浸透处理的单个细胞样品摆放在包埋板孔的一端，采用梯度升温聚合固化:37°C烤箱内12-24小时；60°C烤箱内12-24小时；
[0022](10)、修块及超薄切片:超薄切片机切片，厚度:50-100nm ;
[0023](11)、染色:采用质量百分浓度1-3%醋酸铀染色液和柠檬酸铅染色液对超薄切片进行双染色；
[0024]醋酸双氧铀染色液:3.85g醋酸双氧铀，用50ml 50%或70%乙醇配制成饱和醋酸双氧铀染色液，充分溶解后过滤，pH3.4-4.0，4°C冰箱保存；
[0025]柠檬酸铅染色液:
[0026]配方:
[0027]硝酸铅1.33g ；
[0028]柠檬酸纳1.76g ddH20，用前煮沸并冷却，30ml ;
[0029]配置方法:⑴分别称取硝酸铅和柠檬酸纳，并依次加入50ml容量瓶中，再加入30ml的ddH20，震荡30分钟，直到成为乳白色混悬液(这说明已经完成从硝酸铅到柠檬酸铅的化学反应过程)；(2)向混悬液中加入8ml lmol/1的NaOH溶液(此时溶液变为透明)；(3)过滤到一个棕色瓶中，密封，4°C冰箱保存(若有条件可在液面上加少量液体石蜡油)。
[0030]采用上述技术方案的单细胞透射电镜制样方法，针对常规超薄切片技术的制样目前面临的问题:常规超薄切片技术的制样对的生物样品有一定的体积，一般是肉眼可见；而单个细胞体积小且颜色不显眼，无法进行单个细胞超薄切片样品制备。本发明在常规的超薄切片技术的制样基础上，通过对单个细胞进行甲苯胺蓝染液染色和琼脂预包埋，以实现单个细胞的可视化和可操作化；修改优化常规制样流程。本发明方法解决了常规超薄切片样品制样方法无法满足单个细胞进行电镜样品制备，进而无法对单细胞的超微结构进行研究和病理诊断分析的问题。
[0031]综上所述，本发明是一种能满足单个细胞电镜样品制备要求，进而能对单个细胞的超微结构进行研究和病理诊断分析的单细胞透射电镜制样方法。
【具体实施方式】
[0032]下面结合具体实施例，进一步详细说明本发明。需说明，所举实施例仅用于本发明而不在于限制本发明之范围；依本发明为蓝本，本领域技术人员对该发明所作的各种改动或修改，包含在本发明申请所附权利要求书所限定的范围。
[0033]实施例1:
[0034]单个卵子透射电镜制样方法的具体步骤为:
[0035]1、在体视显微镜下，将单个卵子置于装有10微升2.5% (体积浓度)戊二醛的0.2mlEP管中，4°C固定30分钟；
[0036]2、准备一张干净的载玻片，用免疫组化笔在玻片中间画一个直径Icm的圆圈，干燥10秒，之后将上述包含有单个卵子的液体转移到圆圈正中间；在体视显微镜下检查单个卵子是否在载玻片上；
[0037]3、置于室温中，让液体刚好蒸发完，在体视显微镜镜下，及时加8微升甲苯胺蓝染液(Toluidine Blue,质量百分浓度I %体积浓度，PBS配制)，染色2分钟后，用0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS)轻轻洗去染液；
[0038]4、将载玻片置于冰上，滴加40微升融化的质量百分浓度2%琼脂(冷却至55°C后再加，以免损伤细胞形态)，进行预包埋；
[0039]5、待琼脂完全凝固后，将包含有单个卵子的琼脂块转移至常规透