检测啤酒和麦汁中的四种麦香类风味物质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种啤酒和麦汁的分析检测方法，具体涉及一种啤酒和麦汁中麦香味 物质的检测方法，尤其涉及一种利用UPLC-MS/MS检测啤酒和麦汁中的四种麦香类风味物 质的方法。
【背景技术】
[0002] 啤酒是世上历史最悠久、普及范围最广的酒精饮料之一。它主要是通过大麦麦芽 糖化及发酵酿制而成。啤酒以麦芽（包括特种麦芽）为主要原料，以大米或其它谷物为辅 助原料，经麦芽汁的制备，加酒花煮沸，并经酵母发酵配制而成的，含有二氧化碳、起泡的、 低酒精度的各类熟鲜啤酒。啤酒具有独特的苦味和香味，营养成分丰富，含有各种人体所需 的氨基酸及多量维生素如维生素 B、泛酸以及矿物质等。
[0003] 麦香是啤酒中重要的风味物质，是啤酒的典型风味特征之一。啤酒中麦香风 味物质包括呋喃、呋喃酮、吡喃、麦芽酚、吡咯、吡嗪等，主要来源于美拉德反应和酵母代 谢。啤酒中麦香物质的检测以往都是采用气相色谱-质谱（GC-MS)法。发明专利申请ZL 200910311435. 7提供了一种"检测啤酒中吡嗪类化合物的分析方法"。该方法采用顶空固相 微萃取与气相色谱/质谱分析联用的方法，步骤包括准备、顶空固相微萃取、气相色谱/质 谱分析、待测组分进入检测器进行检测，固相微萃取程序采用75 μπι聚二甲基硅氧烷萃取 纤维头，萃取效果好。该方法建立了测定啤酒中挥发性吡嗪成分的分析方法，即顶空固相微 萃取法与气相质谱联用法。发明专利ZL 200910311436. 1提供了一种"检测啤酒中呋喃类 化合物与吡喃类化合物的分析方法"。该方法采用固相萃取分析法与气相色谱/质谱分析法 联用的方法，它包括准备、固相萃取、气相色谱/质谱分析、检测等步骤。固相萃取过程中， 选择的聚苯乙烯/二乙烯苯小柱，具有吸附能力强，有机溶剂用量少、便捷、安全、高效等特 点。
[0004] 然而，采用顶空固相微萃取方式进样，通常涉及气液平衡、萃取纤维头的吸附以及 脱附环节，导致采样量少，严重影响重现性和灵敏度。而如果采用直接进样方式，进样口 250Γ高温会导致样品中残留的糖和氨基酸反应生成呋喃酮、麦芽酚等物质，严重影响数据 的准确性。目前，超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS)的应用主要集中在食品安全领 域，如农药残留、兽药残留、真菌毒素、塑化剂、添加剂等。这些化合物的分子量多在300附 近，且结构上带有氯，硫，磷等基团，容易离子化并在二级质谱生成特征碎片。但啤酒中麦香 风味物质属于小分子强极性化合物，其分子量通常不超过200,是结构上带有氧原子、氮原 子的杂环化合物。这样的结构特点使其不容易离子化，且二级质谱的特征碎片由于分子量 更小，通常低于100,会有较多的基质干扰。因此，根据公开的技术资料，难以将超高效液相 色谱串联质谱（UPLC-MS/MS)直接应用于啤酒中麦香风味物质的检测。此外，价格因素也制 约了 UPLC-MS/MS在啤酒风味物质的检测的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术存在的上述问题，提供了一种利用超高效液相色谱加串连质 谱（UPLC-MS/MS)检测啤酒中和麦汁中的四种麦香类风味物质的方法。
[0006] 本发明的技术方案：检测啤酒和麦汁中的四种麦香类风味物质的方法，所述四种 麦香物质为麦芽酚（Maltol)、2, 5-二甲基-4-羟基-3(2H)_呋喃酮（DMHF)、2_乙酰吡咯 (2-Acetylpyrrole)和4-羟基-5-乙基-2-甲基-3(2H)呋喃酮（EMHF);所述方法包括以 下步骤：待测样品经前处理后，超高效液相色谱进样并分离，串联质谱定量分析四种麦香风 味物质的含量。
[0007] ①啤酒和麦汁样品前处理。分别用5_7ml乙腈和5_7ml水活化C18小柱。啤酒样 品和发酵液要先排气后上样。麦汁样品无需此操作。取Iml样品流经活化后的C18小柱， 0. 9-1. Iml超纯水淋洗，乙腈和0. 1 %甲酸混合溶液（体积比为50 :50) I. 4-1. 6ml分两次洗 脱，洗脱液经〇. 22 μ m复合膜过滤后进样分析。采用C18固相萃取小柱净化样品，降低了干 扰，提高了灵敏度和重现性。通过上述步骤处理后，可以净化样品，达到去除干扰的效果。
[0008] ②超高效液相色谱（UPLC)进样并分离。所述液相色谱的参数设置为：
[0009] 色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3L 8 μπι 2. lX50mm(Waters 公司）；柱温：35Γ ;
[0010] 采用水相和有机相梯度洗脱，所述水相为A :0.1 %甲酸水溶液；所述有机相为B : 0. 01 %甲酸-乙腈溶液；梯度洗脱条件详见表1。
[0011] 表1.液相色谱的梯度洗脱条件
[0013] 待测组份经过色谱柱有效分离，是准确定量的前提和保证。而合适的色谱条件，如 色谱柱，柱温，流动相，梯度洗脱条件都会影响分离效果。其中，色谱柱填料的性质决定了其 适用范围。ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱设计用于在反相UPLC条件下保留和分离极性有机 化合物。麦香类化合物的特性适合采用这款色谱柱进行分离。流动相的组成也会影响到分 离的效果；通常选择水相和有机相进行梯度洗脱。流动相中加入甲酸，提高了被测化合物的 离子化效率、调节 PH、改善峰形，从而提高灵敏度和分离效果。梯度洗脱程序是流动相的比 例及流速随时间变化的过程，这样可以调节待测化合物在色谱柱上的保留特性，保证各组 份被洗脱时不被其他组份干扰从而准确定量，待测物全部流出后，要加大有机相的比例以 充分清洗色谱柱。本方法中，0~6. 0分钟，待测组份依次被洗脱；6. 0~8. 0分钟，清洗色 谱柱；8. 0~10. 0分钟，重新回到初始条件，为下次进样做准备。
[0014] ③串联质谱（MS/MS)分析。待测组份经过色谱柱分离后，在高压电场和载气的作 用和带动下发生电离，然后进入质谱检测器被检测。质谱方法包括诸多参数，包括锥孔电 压、碰撞能量、母离子、定量子离子、定性子离子，驻留时间等。经过实验，质谱调谐参数如 下：电喷雾离子化正离子模式ESI (+);毛细管电压为700V，一级锥孔电压22V;去溶剂气 温度为400°C ;去溶剂气流量为1000L/h ;锥孔反吹气流量为100L/h ;碰撞气氩气流量为 0. 15ml/min。所述质谱参数分别详见表2。
[0015] 表2.检测对象的物理指标和质谱的定性定量参数
[0017] ④数据采集并定量分析四种麦香风味物质的含量。
[0018] 制作标准曲线：称取适量的麦芽酚、DMHF、2-乙酰吡咯、EMHF，用乙腈溶解配制成 1000mg/L的单组份标准溶液；然后将上述单组份标准溶液用0. 1%甲酸水溶液溶解配制成 浓度为 50 μ g/L、100 μ g/L、200 μ g/L、400 μ g/L、500 μ g/L、1000 μ g/L 的混合标准溶液。将 上述标准溶液盛放于样品瓶中，经自动进样器进样、超高效液相色谱分离和电喷雾离子化 后进入质谱检测器，得到标准样品的谱图。以各组分的峰面积为y，浓度为X，绘制一条标准 曲线（详见表3)，强制过原点。
[0019] 将浓度为200 μ g/L的麦香化合物混合标准溶液重复进样检测6次，计算相对标准 偏差％ RSD。标准曲线和重现性指标见表3。线性和重现性指标较好，R2大于0.98,相对标 准偏差（RSD)均低于3%，可以满足准确定量的需要。
[0020] 表3 :标准曲线和重现性数据
[0022] 检测方法的回收率和检出限指标见表4。在啤酒和麦汁中加入不同浓度的四种麦 香风味物质的标准溶液，四种麦香风味物质的添加量分别为10 μ g/L、50 μ g/L和100 μ g/ L，测得加标回收率在70%~97%之间。将四种麦香化合物的混合标准溶液逐步稀释，以3 倍信噪比作为最小检出限，10倍信噪比作为最小定量限。
[0023] 表4 :最小检出限和加标回收率
[0025] 检测待测样品：分别用5-7ml乙腈和5-7ml水活化C18小柱。啤酒样品和发酵液 要先超声排气10分钟后上样，麦汁样品无需此操作。取Iml样品流经活化后的C18小柱， 0. 9-1. Iml超纯水淋洗，乙腈和0. 1 %甲酸混合溶液（体积比I: I) I. 4-1. 6ml分两次洗脱， 洗脱液经0. 22 μ m复合膜过滤后进样分析。将所得谱图与标样对照，以化合物色谱峰的保 留时间和定性离子对为定性依据，以定量离子对为定量依据。将定量离子对的峰面积带入 标准曲线，计算样品中麦芽酚、DMHF、2-乙酰吡咯和EMHF的含量。
[0026] 本发明的有益效果：本发明涉及的四种麦香物质沸点较高，分别为215°C，220°C， 248°C和285°C;且含量低。采用UPLC-MS/MS检测高沸点的微量啤酒风味物质；避免了气相 色谱法法的进样口 250°C高温会导致样品中残留的糖和氨基酸反应生成呋喃酮、麦芽酚等 物质，进而严重影响数据准确性的问题。
【附图说明】
[0027] 图1是四种麦香物质标样总离子流图，四种麦香物质的浓度均为500ug/L ;其中： 1，麦芽酚；2, DMHF ;3, 2-乙酰吡咯；4, EMHF ;
[0028] 图2是啤酒样品的总离子流图；其中：1，麦芽酚；2, DMHF ;3,2_乙酰吡咯；4， EMHF ；
[0029] 图3是麦汁样品的总离子流图；其中：1，麦芽酚；2，DMHF ;3,2_乙酰吡咯；4，EMHF。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0031] 实施例1 :
[0032] 检测啤酒中的四种麦香类风味物质（麦芽酚（Maltol)、2,5_二甲基-4-羟 基-3(2H)_呋喃酮（DMHF)、2_乙酰吡咯（2-Acetylpyrrole)和4-羟基-5-乙基-2-甲 基-3(2H)呋喃酮（EMHF))的方法；啤酒样品选择不同品牌的6种下面发酵啤酒和4种IPA 啤酒。所述方法包括以下步骤：
[0033] ①啤酒样品前处理。分别用6ml乙腈和6ml水活化C18小柱。啤酒样品和发酵液 要先排气后上样。取Iml样品流经活化后的C18小柱，Iml超纯水淋洗，乙腈和0. 1 %甲酸 混合溶液（比例为50 :50) I. 5ml分两次洗脱，洗脱液经0. 22 μ m复