一种石斛特征指纹图谱的建立方法

文档序号:9505143阅读:453来源:国知局
一种石斛特征指纹图谱的建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药领域中的一种指纹图谱的建立方法,具体涉及一种石斛特征指纹 图谱的建立方法。
【背景技术】
[0002] 石斛是一种常用的滋补中药,主要为石斛属植物。石斛属植物是兰科植物中最大 的一个属,包括铁皮石斛、金钗石斛、密花石斛、鼓槌石斛等多个品种。在全球范围内,约有 1100多种石斛,其中在我国发现的有76种。石斛的药用历史悠久。早在古代,石斛在《神 农本草经》中就被列为滋补上品,长久以来,随着时代的发展,石斛一直被人们视为珍贵的 中草药,具有十分重要的滋补功效。在临床上,石斛被用于治疗多种疾病,具有增强免疫力、 抗氧化、降血糖和抑制癌症等药理功效。由于人为长期无节制采挖及不合理利用石斛,其野 生资源日趋减少,市场上出现了一些以假乱真、以次充好的现象。此外,由于石斛品种较多, 其品种间的杂交使得其近缘的种存在性状交叉现象,分类区别比较困难。因此,有必要建立 石斛的特征指纹图谱对石斛鲜品、干品的药材质量进行评价。
[0003] 色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段,可以判断药材的真伪、评价优 劣,可以在整体和局部区分不同品种的药材、同一品种野生和种植、同一品种不同产地的药 材、同一品种同一产地不同年份的药材。迄今为止,有关药用石斛HPLC指纹图谱的专利有 1项(CN200810218494. 5),成金乐等对石斛中的酚类和黄酮类成分进行了 HPLC指纹图谱分 析。此方法适合于酚类和黄酮类这两类成分的质量控制。
[0004] 目前我国对石斛的质量控制主要局限于对个别或某几类成分的质量控制,其评价 方式较片面,不足以系统、完整的表明石斛药材的整体质量,急需探索更先进、更有效的质 量控制手段。而HPLC特征指纹图谱建立对鉴别与控制石斛药材和含有石斛药材的复方制 剂的质量具有重要意义,且建立一种能较全面的质量控制方法来尽量对石斛检测到的化学 成分进行质量控制具有重要的意义。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种石斛特征指纹图谱的建立方法,通过此建立方法可控制 石斛药材的质量。采用特征色谱指纹图谱质量控制方式以分析为手段,从中获取反映药用 石斛内在质量的信息,通过对指纹特征的分析比较,评价其内在质量的真实性、一致性和稳 定性。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现:
[0007] -种石斛特征指纹图谱的建立方法,所述方法包括如下步骤:①标准样品溶液制 备:取石斛干燥样品,用粉碎机粉碎,过筛,得石斛粉末,精密称取石斛粉末,加入75%甲 醇,室温下超声30min后取出,过滤,滤液浓缩至干,用75%甲醇溶剂溶解,然后转移至容 量瓶中定容,摇匀,以0. 45 μ m微孔滤膜过滤,即得标准样品溶液;②对照品溶液制备:精 密称取夏佛托苷作为对照品,用75%甲醇(V水:V甲醇=25:75)溶解稀释,制备成浓度为 16. 4 μ g/ml夏佛托苷溶液即为对照品溶液;③标准指纹图谱的测定:分别精密吸取标准样 品溶液和对照品溶液,分别注入高效液相色谱仪进行测定,以对照品夏佛托苷色谱峰作为 指纹图谱的参照峰,计算标准样品各特征峰的相对保留时间和保留峰面积,制定得到标准 指纹图谱。
[0008] 进一步地,步骤①中所述标准样品溶液制备的具体过程为:取石斛干燥样品,用粉 碎机粉碎,过筛,得石斛粉末,精密称取石斛粉末I. 〇〇〇g,置于100mL锥形瓶中,加入50mL 75%甲醇(V水:V甲醇=25:75),室温下超声30min后取出,过滤,滤液旋蒸浓缩至干,用 75%甲醇溶剂(V水:V甲醇=25:75)溶解,然后转移至5ml容量瓶中定容,摇匀,以0. 45 μ m 微孔滤膜过滤,即得标准样品溶液。
[0009] 进一步地,所述精密称取石斛粉末的称量误差不能超过0. 2%。
[0010] 进一步地,所述过筛为过孔径0. 335mm的筛,可以为孔径0. 335mm的药典筛。
[0011] 进一步地,步骤①中所述的石斛为铁皮石斛、霍山石斛、兜唇石斛、齿瓣石斛、金钗 石斛、叠鞘石斛、鼓槌石斛、环草石斛、流苏石斛中的任意一种。
[0012] 进一步地,步骤③中采用高效液相色谱仪进行测定的色谱条件与系统适用性实验 为:色谱柱:Alltima C18 色谱柱(250mmX4. 6mm,5um);流速:1.0ml/min ;柱温:30°C ;进样 量:20ul ;检测波长:280nm,参比波长500nm ;流动相:包括流动相A和流动相B,流动相A为 0. 4%乙酸+20mmol/L乙酸铵水溶液,流动相B为乙腈,并按一定的洗脱梯度进行洗脱,理论 板数按夏佛托苷计算,应不低于10000。
[0013] 进一步地,所述石斛的标准指纹图谱中含有11个特征峰,其中一个为夏佛托苷对 照品的特征峰。该石斛的标准指纹图谱中的11个特征峰的保留时间分别为:10. 83min、 13. 01min、21. 22min、24. 15min、27. 84min、28.80min、43. 32min、44.64min、52.67min、 56. 37min以及66. 15min,其中,保留时间为24. 15min的峰为夏佛托苷对照品的特征峰; 该保留时间的误差一般在±0. 3min内,即该石斛的标准指纹图谱中的11个特征峰的 保留时间分别可能为 10. 83±0· 3min、13. 01±0· 3min、21. 22±0· 3min、24. 15±0· 3min、 27. 84±0. 3min、28. 80±0. 3min、43. 32±0. 3min、44. 64±0. 3min、52. 67±0. 3min、 56. 37±0. 3min 以及 66. 15±0. 3min。
[0014] 进一步地,所述洗脱梯度如下所示:
[0015] 时间(min) A相浓度 B相浓度(%) β 98 2 12: 85 !、 35 76 24 4:5 64 36 25 15 80 :5 95 〇
[0016] 本发明提供了一种石斛特征指纹图谱的建立方法,其主要具有的有益效果为:与 过去的指纹图谱相比,本发明方法具有如下显著的优点和用途:本发明选用夏氟托苷为对 照峰,对石斛中的其他特征峰进行保留时间和峰面积归一化处理,扣除不同批次之间保留 时间漂移、操作误差等影响;本发明在构建指纹图谱的方法中对相对峰面积大于5%的指 纹特征峰进行了定性,突破了以往指纹图谱的过于模糊性,对指纹图谱的主要成分进一步 明确,将石斛指纹图谱的整体性和成分特异性统一起来,从而可以应用于药用石斛的石斛 组培苗、石斛鲜品、石斛干品的质量分级及真伪鉴别。具体地:
[0017] ①本发明所述方法的重现性良好,各共有峰相对峰面积的RSD小于5%,相对保留 时间小于1% ;精密度实验中各共有峰相对峰面积的RSD小于5%,相对保留时间小于1%, 样品在24小时之内稳定性良好。说明各共有色谱峰能够客观地反映石斛的内在品质,可以 作为石斛的质量控制性指标。
[0018] ②本发明建立的特征指纹图谱检测方法对各供试品的前处理方法简单,特征性成 分保留完成,且供试品溶液稳定性良好;
[0019] ③该高效液相色谱方法的精密度较高、重现性良好,分析时间较短,具有一定的专 属性,所得指纹图谱中各指纹峰分离效果较好;
[0020] ④本发明选用峰面积较大的共有峰作为特征指纹峰,通过特征指纹峰相对保留时 间和相对峰面积的比较,能有效地表征药用石斛的质量;
[0021] ⑤本发明所建立的特征指纹图谱以夏佛托苷对照品为参照峰,确保各特质指纹峰 的相对稳定性。
【附图说明】
[0022] 下面根据附图对本发明作进一步详细说明。
[0023] 图1是本发明实施例所述的对照品夏佛托苷色谱峰的HPLC图;
[0024] 图2是本发明实施例所述的对10批铁皮石斛药材建立的HPLC指纹图谱;
[0025] 图3是本发明实施例所述的铁皮石斛的HPLC指纹图谱;
[0026] 图4是本发明实施例所述的金钗石斛的HPLC指纹图谱;
[0027] 图5是本发明实施例所述的对10批金钗石斛药材建立的HPLC指纹图谱;
[0028] 图6是本发明实施例所述的齿瓣石斛的HPLC指纹图谱。
[0029] 图7是本发明实施例所述的对10批齿瓣石斛药材建立的HPLC指纹图谱;
[0030] 图8是本发明实施例所述的兜唇石斛的HPLC指纹图谱。
[0031] 图9是本发明实施例所述的对10批兜唇石斛药材建立的HPLC指纹图谱;
[0032] 图10是本发明实施例所述的流苏石斛的HPLC指纹图谱。
[0033] 图11是本发明实施例所述的对10批流苏石斛药材建立的HPLC指纹图谱;
[0034] 图12是本发明实施例所述的鼓槌石斛的HPLC指纹图谱。
[0035] 图13是本发明实施例所述的对10批鼓槌石斛药材建立的HPLC指纹图谱;
[0036] 图14是本发明实施例所述的美花石斛的HPLC指纹图谱。
[0037] 图15是本发明实施例所述的对10批美花石斛药材建立的HPLC指纹图谱;
[0038] 图16是本发明实施例所述的叠鞘石斛的HPLC指纹图谱;
[0039] 图17是本发明实施例所述的对10批叠鞘石斛药材建立的HPLC指纹图谱;
[0040] 图18是本发明实施例所述的霍山石斛的HPLC指纹图谱;
[0041] 图19是本发明实
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